Plusieurs études ont permis de mettre en évidence des QTL affectant la résistance au parasitisme chez les ovins. Les régions étudiées dans le cadre de notre étude ont été définies à partir des résultats obtenus par Sallé et al. (2012) et Riggio et al. (2014). Notre objectif est d’évaluer si on retrouve un effet de ces régions sur la résistance au parasitisme chez plusieurs races françaises : Romane (ROM_INRA et ROM_OS), Martinik Black Belly (MBB), Blanc du Massif Central (BMC) et Manech Tête Rousse (MTR).
3.1. Protocoles expérimentaux et populations étudiées
L’espèce Haemonchus contortus a été choisie car elle est la plus répandue au niveau mondial et la plus dommageable pour les animaux. De plus, les animaux résistants à cette espèce le sont également aux principales espèces de strongles. H.contortus constitue donc un
bon modèle pour d’autres parasites. Enfin, H.contortus ayant été utilisé pour de nombreuses expérimentations, les protocoles sont maintenant bien définis.
Le protocole d’infestation expérimentale par H.contortus réalisé sur les races Romane et Martinik Black Belly au domaine expérimental INRA de la Sapinière est décrit sur la figure 3. Trois caractères ont été mesurés : le nombre d’œufs dans les fèces (OPG), la concentration en pepsinogène et l’hématocrite. L’expérimentation comporte deux infestations réalisées à J0 suivies d’une période de 30 jours. A la fin de la première période, les animaux reçoivent un traitement suivi d’une période de repos de 15 jours.
A J0, des prélèvements sont réalisés pour vérifier l’absence d’excrétion d’œufs dans les fèces et mesurer le niveau de base pour le pepsinogène et l’hématocrite pour chaque animal. Les agneaux âgés de six mois sont ensuite infestés avec une dose de 10 000 larves de stade 3 (L3). Puis deux prélèvements sanguins sont réalisés à 14 et 30 jours après l’infestation pour le pepsinogène et l’hématocrite. A 24 et 35 jours après l’infestation l’intensité d’excrétion des œufs est mesurée. Les animaux sont ensuite traités avec de l’ivermectine (Oramec©, Merial) à la posologie de 0,2 mg/kg de poids vif. Le même protocole est suivi pour la deuxième infestation.
Figure 3 : Protocole d’infestation utilisé pour les populations Black Belly et Romane du domaine expérimental de Bourges.
Quatre races ont été étudiées, dont la Romane représentée par deux populations : une population issue du troupeau expérimental de la Sapinière, l’autre étant issue du troupeau de l’organisme de sélection (tableau 2). La race Martinik Black Belly, adaptée au climat tropical, présente une très bonne aptitude pour la résistance au parasitisme. La race Romane, issue du croisement entre les races Romanov et Berrichon du Cher, est plus sensible au parasitisme comme les autres races métropolitaines. Les données des autres populations ont été récoltées par les organismes de sélection de races confrontées au parasitisme : la Manech Tête Rousse
et la Blanche du Massif Central, deux races souvent menées à l’herbe. Le climat océanique tempéré des Pyrénées-Atlantiques est particulièrement favorable au développement des strongles gastro-intestinaux.
Les protocoles mis en place dans les organismes de sélection diffèrent en certains points de celui appliqué à la Sapinière. Les doses utilisées en station de contrôle individuel sont plus faibles que celles du protocole suivi à la Sapinière afin de préserver les performances des béliers. De plus, seuls deux prélèvements ont été effectués à J0 et J35 après l’infestation pour mesurer l’intensité d’excrétion des œufs et l’hématocrite. La concentration en pepsinogène n’a pas été évaluée.
Tableau 2 : Présentation des populations étudiées et des protocoles appliqués.
Race Dose phénotypésAnimaux génotypésAnimaux prélèvements par infestation)Caractère (nombre de
MBB 10 000 L3
H.contortus 79 79
OPG (3) Pepsinogène et hématocrite (3)
ROM_INRA H.contortus10 000 L3 277 274 OPG (3) Pepsinogène et hématocrite (3)
ROM_OS 3500 L3 puis 5000 L3 H.contortus 189 189 OPG et hématocrite (2) BMC 74 73 OPG et hématocrite (2)
MTR 3000 à 7500 L3 H.contortus 410 203 OPG et hématocrite (2)
3.2. Données génotypiques
Neuf cent trente-deux marqueurs ont été utilisés pour la recherche des QTL sur 8 chromosomes (tableau 3). Une centaine de marqueurs ont été choisis sur 5 centimorgans (cM) autour de zones QTL identifiées par de précédentes études. Pour le chromosome 12, le nombre de marqueurs est plus important car deux régions QTL proches ont été identifiées
dans deux études. Pour le chromosome 21, seuls 10 marqueurs sont utilisés car on souhaite tester les SNP du gène contrôlant la production du pepsinogène.
Tableau 3 : Répartition des marqueurs utilisés lors des analyses sur les huit chromosomes étudiés. Le nombre de SNP étudiés est indiqué ainsi que la taille de l’intervalle sur lequel ils se trouvent.
Chromosome Nombre de SNP Intervalle (cM)
OAR3 113 5 OAR4 109 5 OAR5 113 6 OAR7 116 5 OAR12 262 13 OAR13 101 4 OAR14 108 5
OAR21 10 gène candidat (pepsinogène)
Total 932
Pour les Manech Tête Rousse, l’information génétique disponible est beaucoup plus importante puisque 39 874 marqueurs répartis sur 26 chromosomes ont été utilisés. Cela correspond à une dizaine de SNP par centimorgan.
3.3 Analyses statistiques
3.3.1 Analyses préliminaires des données
Pour chaque caractère, les données ont été analysées grâce à la procédure univariate de SAS® (SAS Institute, Cary, NC, USA) afin d’observer la distribution des données et d’estimer les moyennes et les écarts-types.
Les méthodes d’analyse utilisées par la suite sont basées sur l’hypothèse que les données suivent une distribution gaussienne. Lorsque ce n’était pas le cas, des transformations logarithme et racine quatrième ont été testées pour corriger les écarts à la normalité. La transformation racine quatrième a été retenue car elle a permis de se rapprocher au mieux d’une distribution gaussienne.
Les données ont été vérifiées afin d’écarter les valeurs aberrantes. Les valeurs s’écartant de la moyenne de plus de trois écarts-types sont considérées comme erronées et ne sont pas prises en compte par la suite.
3.3.2. Modèle linéaire
Plusieurs effets environnementaux tels que le sexe, l’âge, la taille de la portée, le mode d’allaitement ou les lots peuvent avoir un impact sur les caractères mesurés. Pour chacun d’eux, les animaux sont répartis en plusieurs niveaux. Grâce à une procédure FREQ de SAS®,
le nombre d’animaux a pu être calculé pour chaque niveau d’effet. Si certains niveaux comptent trop peu d’animaux (moins de 5), on les regroupe afin d’avoir des effectifs suffisants.
Avant d’effectuer l’analyse QTL, on souhaite corriger le modèle pour les effets environnementaux. Pour cela on cherche à identifier ceux qui ont un effet significatif sur les caractères mesurés. Les effets environnementaux ont été testés à l’aide d’une procédure GLM de SAS® dans le cas où ils étaient considérés comme fixes. La procédure GLM est basée sur le modèle suivant :
y = Xβ + ɛ
où y représente le phénotype, X la matrice relative aux effets fixes, β le vecteur des effets fixes et le vecteur des résidus du modèle.ɛ
Une procédure MIXED de SAS® a permis d’identifier les effets environnementaux significatifs dans le cas où l’effet père était considéré comme aléatoire. Le modèle mixed peut s’écrire selon l’équation suivante :
y = Xβ + Z + ɣ ɛ
avec y le phénotype, X la matrice relative aux effets fixes, β le vecteur des effets fixes, Z la matrice relative aux effets aléatoires, le vecteur des effets aléatoires et le vecteur desɣ ɛ résidus du modèle.
Ces procédures utilisent un test de Fisher pour tester la significativité des paramètres.
3.3.3. Qualité des données génotypiques
Il est aussi important de contrôler la qualité des données génotypiques. L’ADN peut être de mauvaise qualité, ce qui est à l’origine d’un grand nombre de données manquantes. Il faut donc identifier les SNP qui présentent un fort taux de données manquantes. Il faut également éliminer les individus pour lequel le taux de succès (call rate) est trop faible car on peut alors supposer que leur génotype n’est pas d’assez bonne qualité. On ne tient pas non plus compte des marqueurs pour lesquels la fréquence de l’allèle mineur (MAF) est trop faible. Dans notre étude, nous avons exclu les SNP pour lesquels la MAF était inférieure à 5% et le call rate inférieur à 90%.
Après ce contrôle, 780 SNP étaient disponibles pour la race Martinik Black Belly, 774 pour la population Romane INRA, 806 pour la population Romane OS et 815 pour la race Blanc du Massif Central. Les données génotypiques de la race Manech Tête Rousse ont été triées avant le début de mon stage, 39 874 SNP étaient disponibles.
3.3.4. Recherche des QTL
La détection des QTL est basée sur l’utilisation d’associations non aléatoires entre les loci des marqueurs et des QTL. On parle de déséquilibre de liaison. Si un marqueur apparaît comme significatif à la suite de l’analyse, cela signifie qu’il existe un QTL proche du marqueur en déséquilibre de liaison avec lui.
Avec le logiciel Muller, l’analyse est réalisée SNP par SNP. La méthode utilisée permet de contrôler le risque de première espèce sur l’ensemble de l’analyse en tenant compte de la relation entre les tests réalisés en chaque marqueur. La présence d’un QTL est ainsi testée en différentes positions du génome. Pour chaque SNP, le logiciel calcule un seuil de rejet pour l’hypothèse d’absence de QTL. Le GWAS est basé sur le modèle suivant proposé par le logiciel BLUPF90 (programme BLUPF90 de Ignacy Misztal et collaborateurs, University of Georgia):
y = 1µ + Xb + Zu + e
dans lequel y représente le vecteur des performances, µ l’effet moyen général à la population, b l’effet de l’allèle, X le vecteur des génotypes au SNP testé, Z la matrice d’incidence des performances sur les valeurs polygéniques, e la résiduelle et où V(u)=Aσ2u, A étant la matrice de parenté.
Le programme Muller utilise un fichier contenant les génotypes, un fichier pour les phénotypes, un fichier pour le pédigrée des animaux et un fichier carte indiquant la répartition des marqueurs sur les chromosomes étudiés. Pour chaque fichier phénotype, un fichier le décrivant est créé (annexe 1). On indique aussi l’héritabilité pour les caractères mesurés qui est de 0,3 dans notre cas.
3.3.5. Comparaison des résultats Emmax et Muller chez les Romanes de la Sapinière
Pour la population de race Romane de la Sapinière, les données avaient été précédemment analysées à l’aide de la méthode Emmax. Le modèle mis en œuvre par cette méthode estime l’effet des SNP en s’appuyant sur une matrice de parenté basée sur l’information génotypique. Dans le cadre de mon stage, j’ai ré-analysé ces données avec la méthode Muller qui utilise une matrice de parenté basée sur le pédigrée des animaux.
Les p-values obtenues avec les deux méthodes ont été comparées pour chaque SNP pour les moyennes des OPG en première et deuxième infestation (fropg1 et fropg2). Les SNP significatifs à 5% et pour lesquels la MAF était supérieure à 10% avec les deux méthodes ont été sélectionnés.
3.4. Sélection des lignées divergentes
Un index u basé à 50% sur l’information génomique et à 50% sur le pédigrée a permis de sélectionner 6 mâles et 77 femelles extrêmes pour leur résistance au parasitisme parmi la population Romane de la Sapinière. Des accouplements entre les animaux résistants d’une part et les sensibles d’autre part ont été réalisés avant le début de mon stage. Deux cent trente-cinq agneaux sont issus de ces accouplements (99 issus des accouplements entre animaux sensibles et 136 issus des accouplements entre animaux résistants).
Lors de mon stage, nous avons sélectionné 180 agneaux parmi les 235 nés. Pour cela, un index sur ascendance a été calculé pour ces agneaux en attribuant à chacun d’eux la moitié de la valeur de l’index u de son père et la moitié de la valeur de u de sa mère. Ces agneaux ont été génotypés pour les 932 SNP.
Puis un index génomique a été calculé en utilisant comme population de référence leurs parents, phénotypés et génotypés pour les OPG en première et deuxième infestation. Les SNP ayant un effet significatif chez les parents avec la méthode de Muller sont standardisés (exprimés en écart-type phénotypique) et utilisés pour prédire la valeur génomique des descendants. L’index génomique est ensuite calculé pour chaque agneau en attribuant les effets des SNP standardisés calculés chez les parents aux agneaux en fonction de leur génotype. Ces index ont permis de sélectionner les agneaux les plus extrêmes pour le projet Gemanema (figure 4). Ce projet a pour objectif d’évaluer plusieurs caractères (analyse du comportement, métagénome par exemple) chez des lignées extrêmes sélectionnées pour leur résistance au parasitisme.
Figure 4 : Etapes suivies pour la sélection des lignées divergentes dans le cadre du projet Gemanema. Les cadres bleus correspondent aux étapes concernant la génération des parents (population Romane INRA). Le cadre bleu ciel contient les étapes qui ont été réalisées avant le début de mon stage. Les cadres violets représentent les étapes suivies pour la sélection de leurs descendants.
Partie 4 : Résultats
Les populations sont désignées dans les tableaux présentés dans cette partie par les abréviations suivantes :
- MTR pour la Manech Tête Rousse
- ROM_INRA pour la population de race Romane issue d’un troupeau du domaine de la Sapinière
- ROM_OS pour la population Romane issue d’un troupeau de l’organisme de sélection - BMC pour la race Blanc du Massif Central
4.1. Distribution des données
Les OPG présentent des écarts à la normale et des distributions asymétriques du fait d’un nombre important de valeurs nulles (figure 5). La transformation racine quatrième a été appliquée afin de les corriger (figure5). Des écarts à la normale ont également été observés pour la concentration en pepsinogène. Ils ont été corrigés de la même manière. Pour la population Romane de la Sapinière, les données brutes de concentration en pepsinogène pour les deuxièmes prélèvements en infestation 1 et 2 (peps2 et peps4) présentaient une distribution proche d’une distribution gaussienne. Aucune transformation n’a été appliquée à ces données. Figure 5 : Graphiques représentant la déviation à la normalité des OPG de la population Romane de Bourges à 24 jours après la première infestation avant (graphique de gauche) et après la transformation (graphique de droite).
Pour l’hématocrite, les données brutes présentent une distribution très proche d’une distribution gaussienne (figure6). Aucune transformation n’a été nécessaire.
Figure 6 : Graphique représentant la déviation à la normalité de l’hématocrite de la population Romane de Bourges à 24 jours après la première infestation.
Plus de deux cents individus ont été pris en compte dans l’analyse pour les races Romane (INRA de Bourges) et Manech Tête Rousse avec respectivement 265 et 205 animaux. Pour les autres races, les données d’une centaine d’individus étaient disponibles : 129 pour la
race Romane (OS) et 104 pour la race Blanc du Massif Central et 79 individus pour la race Martinik Black Belly.
Après avoir éliminé les valeurs aberrantes, le nombre d’animaux conservés par race est de 194 pour la Manech Tête Rousse, 265 pour la Romane (INRA), 102 pour la Romane (OS), 70 pour la Martinik Black Belly et 102 pour la Blanc du Massif Central.
Le tableau 4 présente les principales caractéristiques des données collectées chez les animaux de race Romane (INRA). Ces résultats sont décrits pour les autres races en annexe 2.
Tableau 4 : Statistiques descriptives pour les OPG, le pepsinogène et l’hématocrite avant et après transformation pour la race Romane (INRA). Le tableau présente le nombre d’animaux utilisés pour les calculs, la moyenne, l’écart-type et les valeurs extrêmes pour chaque caractère mesuré.
Romane - INRA de Bourges
Nombre d'observations
utilisées Moyenne Ecart-type Minimum Maximum
Données brutes opg_inf1_j24 264 4956,25 6844,82 0 42600 opg_inf1_j35 258 11167,44 9102,22 0 54400 opg_inf2_j24 248 5257,72 5483,71 0 26250 opg_inf2_j35 250 17441,80 11216,16 0 68000 opg1 257 7966,63 7072,79 0 38300 opg2 248 11337,73 7487,49 0 40975 peps1 223 287,57 286,37 0 1996 peps2 222 91,98 236,78 -787 1063 peps3 233 248,62 202,14 0 1233 peps4 233 80,42 158,57 -532 781 hema1 265 -0,24 3,66 -14 9 hema2 264 -6,31 4,97 -19 7 hema3 262 -2,29 3,20 -12 7 hema4 262 -6,75 4,42 -20 6 Après transformation rac_opg_inf1_j24 264 6,70 3,29 0 14,37 rac_opg_inf1_j35 258 9,54 2,41 0 15,27 rac_opg_inf2_j24 248 6,84 3,51 0 12,73 rac_opg_inf2_j35 250 10,75 2,69 0 16,15 rac_opg1 257 8,70 2,30 0 13,99 rac_opg2 248 9,64 2,42 0 14,23 rac_peps1 223 3,78 0,99 0 6,69 rac_peps3 233 3,71 0,87 0 5,93
Chez les races Romane (INRA) et Martinik Black Belly, le nombre d’œufs dans les fèces augmente entre J24 et J35 lors des deux infestations. Les moyennes calculées pour la variation de l’hématocrite sont, de manière générale, négatives chez toutes les races alors qu’elles sont plutôt positives pour les variations de concentration en pepsinogène. Ces observations correspondent bien à ce qui a pu être décrit dans la bibliographie pour ces caractères. La race Martinik Black Belly présente deux à trois fois moins d’œufs dans les fèces que la race Romane (INRA) en première et deuxième infestations (rac_opg1 et rac_opg2). Les mesures d’hématocrite sont en moyenne plus élevées pour la race Martinik Black Belly. Là encore, nos données sont en accord avec les résultats obtenus pour ces races par de précédentes études. Cela nous permet de penser que les données phénotypiques collectées sont fiables. Pour la race Manech Tête Rousse, quatre protocoles d’infestation différents ont été suivis. L’utilisation de différentes doses a eu un impact très fort sur les caractères mesurés. Les moyennes et écarts-types ont donc été calculés pour chaque protocole. La figure 7 présente les distributions obtenues en première infestation pour chaque protocole. Des différences importantes entre les moyennes et les écarts-types calculés pour chaque protocole peuvent être notées.
Figure 7 : Distribution observée pour les OPG en première infestation chez la race Manech Tête Rousse (protocole 1 en haut à gauche, protocole 2 en haut à droite, protocole 3 en bas à gauche et protocole 4 en bas à droite.
4.2. Corrélations phénotypiques entre les caractères.
Les corrélations phénotypiques entre les caractères d’infestation sont présentées dans le tableau 5 pour la race Romane (INRA).
Nous avons obtenu de bons coefficients de corrélations phénotypiques entre les OPG en première et deuxième infestation (0,39) et entre les mesures de l’hématocrite hema1 et hema2 pour la première infestation (0,39) et hema3 et hema4 en deuxième infestation (0,48).
Les corrélations entre les OPG et le pepsinogène sont généralement positives. Elles sont au contraire plutôt négatives entre les OPG et l’hématocrite et entre le pepsinogène et l’hématocrite. Cependant les coefficients de corrélation obtenus sont plutôt faibles.
Les mêmes tendances ont été observées chez les autres races (annexe 3).
Tableau 5 : Corrélations phénotypiques estimées entre les caractères pour la race Romane (INRA de Bourges). Opg inf1 Opg inf2 rac_ peps1 peps2 rac_
peps3 peps4 hema1 hema2 hema3 hema4 fropg1 -0,39 *** NS NS NS NS -0,17 ** -0,61 *** -0,13 * -0,26 *** fropg2 - NS NS NS NS NS -0,21 *** NS -0,5 *** rac_ peps1 -0,27 *** 0,17 * NS NS NS NS 0,15 * peps2 - NS 0,29 *** NS NS NS NS rac_ peps3 -0,24 *** NS NS NS NS peps4 - NS NS NS NS hema1 - 0,39 *** NS NS hema2 - NS 0,24 *** hema3 - 0,48 *** hema4 -4.3. Effets environnementaux
Selon la population étudiée, différents effets fixes ont été testés afin de mesurer l’impact des effets non génétiques et/ou environnementaux sur les caractères mesurés et, si besoin, corriger le modèle utilisé pour la recherche des QTL.
Plusieurs paramètres étaient connus pour les races Romane et Martinik Black Belly infestées au domaine de la Sapinière. La taille de la portée, le sexe et les lots formés ont été testés chez les deux races. Le mode d’allaitement n’a pas pu être testé chez la Martinik Black
Belly car seulement quatre animaux sur 79 ont été allaités artificiellement. Chez la race Romane, le mode d’allaitement a eu un effet significatif sur les trois caractères mesurés lors de la première infestation (p-value de 0,0007 pour la moyenne des OPG en première infestation). Le sexe a eu un effet significatif en deuxième infestation chez les deux races (p-value<0,0001 pour la moyenne des OPG en deuxième infestation chez les deux races). Les lots d’infestation ont également eu un effet significatif en première et deuxième infestation pour les deux races.
Les données de la race Romane de l’organisme de sélection ont été collectées en 2011 et 2012. L’effet année a été considéré car les conditions d’infection (virulence de la souche notamment) et climatiques ainsi que l’alimentation ont pu varier d’une année à l’autre et avoir un effet sur les OPG et les mesures d’hématocrite. L’élevage d’origine a aussi été testé. Les analyses ont révélé un effet significatif de l’année en deuxième infestation pour les OPG (p-value de 0,01) mais pas de l’élevage d’origine.
Les béliers phénotypés de race Blanc du Massif Central sont issus de deux élevages. Ce paramètre a eu un effet significatif sur les OPG et l’hématocrite en deuxième infestation.
Les données phénotypiques de la race Manech Tête Rousse ont été collectées en 2008, 2009 et 2011 après infection par H.contortus. En 2008, deux protocoles d’infestation ont été