Matériel et méthodes du modèle in vivo

4.1.1 Expérimentations relatives au modèle murin

Toutes les procédures impliquant l’utilisation de souris ont été examinées et approuvées par le comité de protection des animaux de l’Université Laval (approbation # 2014084) sous l’autorité du Conseil canadien de protection des animaux. Des souris C57BL/6 femelles de 8 semaines (Charles Rivers, St- Constant, Canada) ont été anesthésiées avec de l’isoflurane et instillées par voie intranasale avec 50 µl de PBS, ou d’éluats d’échantillons terrains dans du PBS (0,1 m3 _{d’air) obtenus avec le SASS 3100. Les souris ont été euthanasiées 24}

heures suivant l’instillation par une surdose de kétamine-xylazine. La vasculature pulmonaire a été perfusée avec du PBS via le ventricule droit et les souris ont été trachéotomisées afin d’effectuer des lavages bronchoalvéolaires (LBA), à raison de trois fois 1 ml de PBS. Les échantillons ont été centrifugés à 500 x g et le surnageant a été congelé à -80oC pour analyses ultérieures. Le culot cellulaire a été resuspendu dans un volume connu de PBS pour effectuer des comptes de

cellules totales. Les cellules viables totales dans les LBA ont été comptées en utilisant un hémacymètre et une exclusion des cellules mortes à l’aide d’une coloration au bleu de trypan a été effectuée (Marsolais et al. 2011). Des comptes différentiels ont également été effectués sur des cytocentrifugations en utilisant la trousse Hemacolor (Thermofisher, Waltham, MA). Pour chaque souris, le nombre absolu des types cellulaires a été obtenu en multipliant le nombre total des cellules présentes dans les LBA par le pourcentage de chaque type cellulaire obtenu par les comptes différentiels.

4.1.2 ELISA

La cytokine pro-inflammatoire TNF ainsi que l’albumine, une protéine utilisée pour jauger la perméabilité vasculaire ont été quantifiées dans le surnageant des lavages bronchoalvéolaires des souris, avec les trousses de quantification TNF ELISA MAX™ Standard (Biolegend) et le Mouse Albumin ELISA Quantitation Set (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX), respectivement.

4.1.3 Analyses statistiques

Les données in vivo sont exprimées par la moyenne et l’erreur type de la moyenne (SEM). Une ANOVA unidirectionnelle a été utilisée pour comparer les groupes à l’aide du logiciel GraphPad Prism. Les résultats sont considérés significatifs à des valeurs de P ≤0,05.

4.2 Résultats

Afin de déterminer si l’activation des cellules dendritiques s’aligne avec le potentiel immunogène in vivo des éluats d’air, les voies respiratoires des souris ont été exposées aux échantillons d’air testés in vitro. L’inflammation a été évaluée 24

heures plus tard dans les LBA (Figure 4.1). Tel qu’attendus, les LBA des souris contrôles ayant reçu du PBS ne présentaient aucune inflammation. Ils étaient principalement composés de macrophages alvéolaires (84,5 ± 3,7 %), sans accumulation importante de neutrophiles (10,8 ± 3,6 %) ou d’éosinophiles (0,7 ± 0,33 %) (Figure 4.1A), et contenaient un faible nombre de cellules (0,047 ± 0,007 x 106 cellules/ml) (Figure 4.1B). Par contre, un nombre beaucoup plus élevé de cellules totales dans les LBA provenant des souris exposées aux éluats de porcheries a été dénombré (entre 0,31 et 1,6 x106 cellules/ml); et était significativement supérieur à celui des souris exposées à l’éluat d’air de ferme laitière (0,10 ± 0,01 x 106 cellules/ml), et à celui des souris exposées à l’éluat d’air de l’usine de traitement des eaux usées (0,082 ± 0,006 x 106 cellules/ml) (Figure 4.1B).

Les neutrophiles sont généralement le type cellulaire le plus recruté au poumon dans un modèle d’inflammation aiguë. Donc, il était attendu qu’une modulation de l’infiltration neutrophilique pulmonaire serait détectée pour les éluats d’air des environnements de travail plus immunogènes. En effet, les porcheries ont causé la plus grande accumulation de neutrophiles dans les LBA (de 75 à 93 %), suivi de la ferme laitière (25,0 ± 6,2 %) et de l’usine d’épuration des eaux usées (15,0 ± 3,2 %) (Figure 4.1A). L’accumulation de la cytokine inflammatoire TNF dans les LBA a suivi la même tendance (Figure 4.1C), de même que l’accumulation de l’albumine dans les LBA (Figure 4.1D). L’albumine, une protéine du sang, est un excellent indicateur d’infiltration de plasma ou d’œdème pulmonaire et donc, un marqueur de dommages pulmonaires. Les éluats d’air des porcheries 3 et 4 (SW#3 et SW#4) induisent une accumulation significative de TNF et d’albumine dans les LBA en comparaison des souris contrôles instillées au PBS.

En conclusion, la réponse inflammatoire aiguë est en adéquation avec l’activation des cellules dendritiques selon le statut sanitaire des différentes catégories d’environnements testés au cours de ce projet. Cependant nos modèles in vitro et in vivo ne semblent pas être en mesure de stratifier les environnements de façon individuelle dans une même classe de statut sanitaire.

Figure 4.1 Le potentiel inflammatoire des éluats d’air d’environnements de travail

dans un modèle aigu d’exposition des voies respiratoires. Des souris ont été

instillées par voie intranasale avec du PBS ou avec 0,1 m3 _{d’éluats d’air}

d’environnements échantillonnés élués dans du PBS. Des lavages bronchoalvéolaires ont été effectués 24 heures suivant la dernière instillation. Les comptes de macrophages (Mo), de lymphocytes (Ly), de neutrophiles (No) et d’éosinophiles (Eo) ont été effectués en A) pourcentages et en B) nombres de cellules/ml de lavage. La quantification de C) TNF et de D) l’albumine a été effectuée dans le surnageant des lavages bronchoalvéolaires. Les données sont exprimées selon leur moyenne ± SEM (n=5~11). * : p<0,05; ** : p<0,01; **** : p<0,001. SW : porcherie, DB : ferme laitière et WTP : usine de traitement des eaux usées. PBS SW # 1 SW # 2 SW # 3 SW # 4 DB #1 WTP #3 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 Environments BAL albumin ( µ g/ml) * **** **** Mo Ly No Eo 0 20 40 60 80 100 % BAL cells ****** **** PBS SW # 1 SW # 2 SW # 3 SW # 4 DB #1WTP #3 0 50 100 250 300 350 400 450 500 Environments BAL TNF (pg/ml) **** **** Mo Ly No Eo 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 BAL cells/ml (x 10 6) PBS SW #1 SW #2 SW #3 SW #4 DB #1 WTP #3 **** **

C

D

A

B

CHAPITRE V: DISCUSSION

Plusieurs travailleurs présentent des symptômes ou des pathologies respiratoires reliées à l’exposition aux bioaérosols de leur milieu de travail. L’étiologie d’une forte proportion de ces pathologies respiratoires demeure mal définie. En effet, les mécanismes de pathogenèse des bioaérosols non infectieux sont complexes et encore mal compris, ce qui entraine l’absence de déterminant efficace pour évaluer la qualité de l’air. De plus, la caractérisation complète des composantes potentiellement nocives des bioaérosols demeure impossible, ce qui rend difficile l’évaluation de la qualité de l’air des environnements de travail. Les travaux décrits dans ce mémoire démontrent que les cellules dendritiques peuvent être utilisées en tant qu’outil biologique alternatif afin de jauger le potentiel immunogène de l’air d’environnement de travail.

En effet, l’activation différentielle des cellules dendritiques permet de discriminer des composantes fortement immunogènes des composantes peu immunogéniques des bioaérosols. De plus, une stimulation combinée d’agents retrouvés dans les bioaérosols peut avoir un effet additif sur l’activation des cellules dendritiques. Nous avons également démontré que la cinétique d’activation est modulée par la nature des stimuli, ce qui suggère que plusieurs composantes peuvent interagir de manière synergique sur le système immun. De façon importante, notre modèle d’activation des cellules dendritiques a permis de stratifier différents environnements de travail selon leur statut sanitaire, ce qui a été confirmé par une modulation différentielle de l’inflammation pulmonaire des souris exposées à ces environnements. Enfin, nous avons démontré que les endotoxines et la poussière totale contenues dans les bioaérosols sont les deux meilleurs prédicteurs de l’activation des cellules dendritiques. Par contre, l’activation des cellules dendritiques est souvent supérieure à son contenu en endotoxines, ce qui suggère l’implication d’autres composantes sur l’activation des

cellules dendritiques. Ainsi, les bactéries totales et les archées totales ont été identifiées comme paramètres corrélant avec l’activation des cellules dendritiques.

5.1 Les méthodes de culture cellulaire et de récolte d’échantillon d’air sont