Matériel et Méthodes

Schéma expérimental et prélèvements a.

Les prélèvements respiratoires ont été obtenus dans des fermes d’élevages naisseurs du sud-Ouest de la France. Les animaux à prélever étaient des veaux âgés de 2 semaines à 4 mois et présentant des signes cliniques de bronchopneumonie. Une vingtaine de cabinets vétérinaires de 7 départements ont été contactés au cours de l’automne 2013 pour nous prévenir en cas d’apparition de BPI dans leurs élevages, les départements concernés étaient la Haute-

82 Garonne, le Gers, l’Ariège, les Hautes-Pyrénées, le Tarn, le Tarn-et-Garonne et l’Aveyron. Les critères d’inclusion pour les cas sélectionnés étaient les suivants :

Veaux âgés de 0 à 4 mois, présentant des signes cliniques d’atteinte de l’appareil respiratoire profond (broncho-pneumonie sur un lot ou plusieurs animaux) : hyperthermie > 39.5° – 40°C avec de la toux, une tachypnée et une dyspnée (modification des mouvements respiratoires, bruits respiratoires renforcés et si possible surajoutés (type râle) à l’auscultation).

Évolution aiguë (depuis 3 à 4 jours maximum) avec un nombre minimal de 3 veaux atteints.

Les critères d’exclusion étaient les suivants :

Ancienneté des signes cliniques (les troubles respiratoires étaient présents depuis plus de 5 jours). De même, au sein d’un élevage, n’étaient prélevés que les animaux malades depuis moins de 3-4 jours ou en phase d’hyperthermie, les autres étant exclus.

Présence de traitements antibiotiques préalables et/ou vaccination préalable contre les virus respiratoires.

En bilan 93 veaux atteints de BPI de 23 élevages ont été prélevés, soit entre 3 et 5 veaux par élevage. Deux types de prélèvements ont été réalisés pour chaque veau : un écouvillonnage nasal profond (ENP, appareil respiratoire superficiel) et un lavage bronchoalvéolaire (LBA, appareil respiratoire profond).

L’ENP a été effectué au moyen d’un écouvillon stérile de 20 cm avec embout en coton et manche en plastique pour éviter qu’il se casse en cas de mouvements de l’animal. Pour des veaux âgés de moins de 4 mois, la contention physique de l’animal suffisait à la réalisation des ENP. L’écouvillon était introduit dans la narine de l’animal le plus loin possible vers le méat dorsal puis vigoureusement frotté contre la muqueuse nasale jusqu’à la rosée sanguine par un mouvement de va-et-vient pendant une dizaine de secondes. Il était ensuite élué dans un mL de soluté salé physiologique puis conservé au froid positif durant le transport avant d’être congelé à -80°C, dans l’attente d’être analysé.

83 Les LBA ont été réalisés sous anesthésie générale par endoscopie (gastroscope pour petits veaux et colonoscope pour veaux de taille moyenne et jeunes bovins). Brièvement les veaux en hyperthermie et ne présentant pas de troubles respiratoires trop sévères étaient anesthésiés au moyen d’un mélange ketamine-diazepam (4 ml d’Imalgène 1000 (100 mg/ml) et 2 ml de Valium Roche (5 mg/mL)). Cette technique permet une anesthésie rapide, elle protège le veau, les opérateurs et le matériel. Par ailleurs, ce protocole permet une anesthésie de courte durée, ce qui est préférable pour des veaux présentant des troubles respiratoires, mais aussi une bonne myorelaxation (diazépam) qui facilite la mise en place de l’endoscope (passage du larynx et progression jusqu’aux bronches). L’endoscope est introduit par voie buccale en étant préalablement protégé par la mise en place d’un tube de plastique rigide dans la bouche de l’animal pour avoir un accès direct au larynx sans risque de contamination par la flore buccale. Une fois l’endoscope bloqué dans une bronche intermédiaire du lobe crânial droit, 100 mL de liquide physiologique stérile étaient injectés puis ré-aspirés, à l’aide d’une seringue d’au moins 50 ml. La quantité de liquide récupérée variait entre 35 et 70 mL. Le prélèvement était ensuite placé dans un tube stérile puis conservé au froid positif durant le transport avant d’être traité au laboratoire. Entre chaque prélèvement, l’endoscope était nettoyé à l’aide d’une solution physiologique. Entre chaque élevage, une désinfection complète à base d’ammoniums quaternaires (Amnios) était réalisée, selon les normes et le protocole du fabricant.

Traitement des échantillons b.

Pour les EN, 250 µL de solution d’ENP a été mélangée à 750 µL de Trizol LS (réactif permettant d’isoler l’ARN). Le reste de la solution a été aliquoté dans deux tubes eppendorf. Le tout a été conservé à -80°C. Les échantillons issus de LBA, une fois arrivés au laboratoire, ont tout d’abord été filtrés sur gaze, pour éliminer les gros débris fibrino-cellulaires. Le liquide de LBA a ensuite été divisé en deux parties. Une première partie du liquide, de 20 à 25 mL, a été centrifugé pendant 20 minutes à 1200-1500 tours/minute. Cette centrifugation permet d’obtenir deux phases : le surnageant et le culot cellulaire. Le surnageant a été récolté et aliquoté dans deux tubes eppendorf de 2 mL et dans des tubes de 5 mL.

84 Quant au culot cellulaire, il a été repris dans 1.5 mL d’une solution tampon PBS (Phosphate Buffered Saline) puis stocké dans deux tubes eppendorf à -80°C. L’autre partie du liquide filtré a été traitée directement sans être centrifugée. Deux tubes contenant 250 µL de ce liquide et 750 µL de Trizol LS ont été conservés à - 80°C ainsi que deux tubes contenant 140 µL de ce liquide associé à 140 µL de tampon de lyse du kit d’extraction d’ARN (RNeasy, Qiagen®). Le reste a été directement conservé à -80°C.

Détection des pathogènes respiratoires majeurs par RT- c.

qPCR

Les prélèvements d’un même élevage ont été mélangés avant l’analyse. Pour chaque mélange, une recherche des virus BRSV, BCoV, BPI3 et des bactéries M. haemolytica, P. multocida, H. somni et M. bovis a été réalisée en utilisant un kit commercial RT-qPCR One step, basé sur la méthodologie Taqman (LSI Vetmax screening Pack- Ruminant Respiratory Pathogens – Life technologies).

Caractérisation du virome respiratoire superficiel et d.

profond des veaux par séquençage métagénomique avec la méthode Illumina

Pour le séquençage à haut débit, 300µL de chaque prélèvement d’ENP et 3 mL de LBA ont été filtré à travers un filtre de 0,45µm à l’aide d’une seringue stérile. Ensuite le filtrat contenant les particules virales a été concentrées par ultracentrifugation (100000 g, 2h, 4°C). Les culots obtenus après l’ultracentrifugation des ENP et LBA ont subi un traitement nucléase (Exonuclease I (20U, Thermo Fischer, USA), Benzonase (25U, Merck chemical, Germany), Turbo DNAse (2U, Thermo Fisher Scientific, USA), RNase I (10U, Thermo Fischer, USA)). Le traitement des échantillons aux nucléases sert à éliminer les acides nucléiques libres donc non encapsidés, une étape qui va favoriser l’enrichissement en acides nucléiques viraux.

85 Après une incubation d’une heure à 37°C, les acides nucléiques ont été extraits à l’aide du kit Qiamp minElute virus spin kit de Qiagen et amplifiés par transcriptase inverse et PCR aléatoire. Brièvement, des amorces aléatoires (octomères) portant une étiquette ont été utilisées pour la rétrotranscription et la PCR. Les étiquettes utilisées étaient les suivantes : Tag-D CGTAGATAAGCGGTCGGCTC et Tag-E CATCACATAGGCGTCCGCTG. Les étiquettes servent à l’identification de chaque échantillon après l’étape de séquençage. Une étape de Klenow est nécessaire pour la création d’un ADN double brin à partir d’une molécule d’ADN simple brin. Les librairies ont été créées en suivant les indications du kit Illumina TrueSeq pour le séquençage sur la plateforme Illumina. Cette méthodologie d’amplification aléatoire est connue sous le nom de SISPA (sequence-independant, single-primer amplification) (Figure 8).

Figure 8 : Représentation du processus de préparation des échantillons pour le séquençage NGS métagénomique du virome respiratoire.

Séquençage et analyse bio-informatique e.

86 Deux séries de séquençage ont été réalisées : le séquenceur Illumina Miseq pour un premier run puis le séquenceur Illumina Hiseq pour une deuxième série (3 runs). Le changement méthodologique a été opéré car le nombre de séquences virales obtenues lors du premier run (Miseq) était faible (4,5 millions de séquences/run, équivalent à 260 000 séquences par échantillon). Les mêmes séries ont donc été analysées par la technique Illumina Hiseq. La différence majeure entre les deux séquenceurs Illumina se résume par le débit de données générées (15 Gb (millions de paires de bases) pour le Miseq contre 650 Gb pour le Hiseq). Parmi les résultats générés par le run Miseq, des génomes complets et partiels de BCoV ont été obtenus, ces données ont été exploitées dans le but de caractériser ces virus. Les informations concernant la caractérisation de BCoV seront détaillées dans la section « Caractérisation génétique des coronavirus bovins – Evolution et épidémiologie moléculaire » de ce manuscrit et dans l’article soumis « Global transmission, spatial segregation and recombination determine the long-term evolution and epidemiology of Bovine Coronaviruses ».

Le circuit bio-informatique utilisé a été le VIP (304). Ce circuit nouvellement créé pour l’identification et la découverte des virus a été installé sur la plateforme bio-informatique Galaxy du centre INRA Occitanie. Le pipeline VIP se caractérise par les étapes suivantes : 1. Contrôle qualité des séquences ; 2. Suppression des séquences hôtes éventuelles (appartenant à Bos Taurus) ; 3. Assemblage des lectures en contigs ; 4. Alignement nucléotidique contre des bases de données virales spécifiques (ViPR/IRD), ou contre les bases de données virales du NCBI ; 5. Assemblage de novo : reconstruction du génome des virus détectés.