B-1. Tests d’induction et paramètres de production
B-1-a. Mise au point des conditions d’expression
Les plasmides pGEX-4T-1-AFT1 et pGEX-4T-1-AFT2 ont été transformés dans les bactéries BL21 préalablement transformées avec le plasmide pRIL. Les cellules sont précultivées durant 18 heures dans le milieu LB contenant les antibiotiques nécessaires au maintien des deux plasmides (ampicilline à 100µg/mL pour le pGEX-4T-1, chloramphénicol à 50µg/mL pour le pRIL). Elles sont ensuite diluées à DO600 = 0,1 dans 10mL de 3 milieux de culture différents : TB (milieu très riche), LB (milieu classique) ou M63 (milieu minimum). L’induction de l’expression des protéines de fusion s’effectue lorsque les cellules ont atteint
une DO600 = 0,6 ou 1,2. Les cellules sont d’abord placées 20 minutes dans la glace pour permettre l’expression des protéines chaperons de choc thermique pouvant faciliter le repliement de la protéine de fusion, puis l’IPTG est ajouté à 1mM dans le milieu pour induire l’expression de la protéine de fusion. La production de la protéine de fusion est alors réalisée à différentes températures : 15°C, 25°C ou 30°C, et durant différentes périodes : 1, 3, 4 ou 18 heures. Dans certains cas, 5mM de bétaïne, chaperon chimique favorisant le repliement des protéines recombinantes, ont été ajoutés simultanément à l’IPTG.
La détermination des paramètres de production de la protéine de fusion GST-Aft2p a conduit à tester l’ajout des composés métalliques fer, cuivre et zinc à des concentrations variables dans le milieu, et sous forme de sulfates (FeSO4, CuSO4, ZnSO4).
Après induction de la production de la protéine de fusion, les cellules sont centrifugées, reprises dans 500µL d’une solution de KH2PO4 0,1M pH7,2 contenant des inhibiteurs de protéases, et traitées par sonication (3x10secondes à 20kHz) pour lyser les cellules et fragmenter l’ADN qui peut rendre les extraits cellulaires visqueux. La concentration des extraits obtenus est estimée par la technique de Bradford (Bradford, 1976). 15µg de protéines totales sont séparées sur gel de polyacrylamide SDS 8% et révélées par coloration au Bleu de Coomassie, ou transférées sur membrane de nitrocellulose pour une immunoempreinte. Les membranes sont saturées avec une solution de TBS/Régilait (Tris-HCl 20mM pH7,5, NaCl 150mM Régilait 5%(w/v)). Les anticorps primaire (Anticorps monoclonal anti-GST, dilution 1/50000e, Pharmacia) et secondaire (IgG anti-chèvre, dilution 1/4000e, Sigma) sont incubés chacun durant 1 heure à température ambiante dans la solution bloquante et la membrane est lavée 3 fois dans du TBS après chaque incubation. L’anticorps secondaire étant couplé à la phosphatase alcaline, les protéines sont révélées en présence de 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (BCIP) et de bleu de tétrazolium nitreux (NBT).
B-1-b. Conditions de cultures pour l’expression de la GST-Aft2p en vue de sa purification
A petite échelle : L’induction de la production de la protéine de fusion GST-Aft2p est
effectuée sur 2 litres de culture, dans les conditions suivantes : les cellules sont cultivées dans un milieu LB, jusqu’à DO600 = 1,2 et incubées 20 minutes dans la glace. La production de la protéine de fusion est induite par l’ajout de 1mM d’IPTG, 5mM de bétaïne et 100µM de
sulfate de fer (FeSO4), pendant 1 heure à 30°C. Les cellules sont reprises dans 8mL de PBS (NaCl 140mM, KCl 2,7mM, Na2HPO4 10mM, KH2PO4 1,8mM pH7,3 ; tampon d’équilibrage des billes de sépharose couplées au glutathion) contenant des inhibiteurs de protéases, lysées à la presse de French avec une pression de 1,2 kbar (One Shot cell disrupter) et le surnageant issu de l’étape de centrifugation à 3000g pendant 5 minutes à 4°C est isolé.
A grande échelle : La protéine de fusion GST-Aft2p est produite à partir de 33 litres de
culture. A cause de contraintes techniques dues à la manipulation de grands volumes de culture, le protocole utilisé pour l’induction diffère du protocole d’induction à petite échelle : après croissance des cellules dans un milieu LB, une incubation de 20 minutes au réfrigérateur a été effectuée, préalablement à l’induction à DO600 = 0,7 avec 1mM d’IPTG, 5mM de bétaïne et 100µM de fer-citrate pendant 2 heures à 30°C. Les cellules sont reprises dans 200mL de PBS contenant des inhibiteurs de protéases, lysées par sonication (5x50secondes à 200Watts) et le surnageant de l’étape de centrifugation à 4000g pendant 2 heures à 4°C est isolé.
B-2. Purification de la protéine GST-Aft2p
B-2-a. A petite échelle
Purification : La purification de la protéine de fusion GST-Aft2p est effectuée en chambre
froide à 4°C par la technique en « batch » (incubation sur roue et changement de tampon par centrifugation des billes à 5000g 2 minutes). 500µL de billes de sépharose couplées au glutathion sont dans un premier temps équilibrés avec 5mL d’un tampon PBS, Triton 0,1%. Le triton est un détergent non-ionique qui permet de réduire les interactions hydrophobes non spécifiques. Les billes sont ensuite incubées pendant 1h30 avec 500µL de l’extrait protéique puis lavées 5 fois avec 1mL de PBS, Triton 0,1%. L’élution de la protéine de fusion est réalisée par incubations successives de 20 minutes avec 1mL de solutions de glutathion réduit à concentration croissante : 2mM, 5mM, 10mM et 50mM de glutathion dans un tampon Tris-HCl 50mM pH8, Triton 0,1% et NaCl 0,2M (pour augmenter la force ionique du tampon d’élution). A chaque étape, 10µL du surnageant sont prélevés et déposés sur gel SDS 8% pour
analyse. Les 4 éluats sont ensuite concentrés sur centricons PM30 (passage de 4mL à 200µL de solution).
Clivage par la thrombine : 100µL des éluats concentrés sont dans un premier temps incubés 15 minutes à 37°C dans une solution de 900µL de Tris-HCl 50mM pH7,4, MgSO4 10mM et ATP 2mM afin de dissocier la protéine chaperon DnaK de la protéine de fusion GST-Aft2p. Le mélange est ensuite incubé 1h45 avec 500µL de billes de sépharose couplées au glutathion, lavé, et incubé la nuit à 4°C en présence de 10 unités de thrombine (dans 1mL de PBS). Le surnageant issu de cette digestion contient en théorie la protéine Aft2p clivée. Afin de récolter un maximum de protéine Aft2p libre, les billes sont lavées 2 fois avec du PBS. A chaque étape de l’expérience, des aliquotes de 10µL sont prélevés pour analyse.
B-2-b. A grande échelle
La purification de la protéine de fusion GST-Aft2p a été réalisée à 4°C sur une colonne contenant 8mL de billes couplées au glutathion, équilibrées avec du PBS. Le surnageant bactérien est passé 3 fois sur la colonne pour autoriser un maximum de fixation de la protéine de fusion sur les billes. La colonne est ensuite lavée avec 50mL de PBS, Triton 0,1%, puis avec 10mL de Tris-HCl 50mM pH7,4, ATP 2mM, MgCl2 10mM, NaCl 0,2M (pour décrocher le chaperon DnaK). L’élution de la protéine de fusion est réalisée en ajoutant les solutions de glutathion réduit suivantes : 10mM dans un tampon Tris-HCl 50mM pH7,5, NaCl 0,2M à pH 3,3 (5mL) ; 10mM dans un tampon Tris-HCl 50mM pH7,5, NaCl 0,2M à pH 7,5 (11,5mL) ; 100mM dans un tampon Tris-HCl 50mM pH7,5, NaCl 0,2M à pH 7,5 (10mL). Une fraction des solutions obtenues à chaque étape de la purification est conservée pour analyse. Les éluats 2 et 3 sont concentrés séparément sur une cellule de concentration Diaflo à température ambiante pendant toute une journée (passage de 11,5mL à 350µL pour l’éluat 2 et de 10mL à 650µL pour l’éluat 3).