Matériel et méthodes

II.2.1. Description du site d’étude

La ville de Kinshasa, capitale de la République Démocratique du Congo (RDC), a à la fois le statut administratif de ville et de province. Située sur la rive sud du fleuve Congo au niveau du Pool Malebo; elle fait face à Brazzaville. Elle est la ville-province la plus peuplée du pays avec une population évaluée approximativement à 9 463 749 habitants, pour un taux d’accroissement de 5,3 % et une superficie de 10.725 Km2 (www.wikipedia.org).

La végétation de la ville a longtemps été dégradée et remplacée par une végétation éparse d’arbres fruitiers tels que : Mangifera indica (Mangier), Elaeis guinensis (Palmier), Persea americana (avocatier), Dacryodes edulis (safoutier), le plus souvent plantés dans les domaines d’habitation privés. Cependant, quelques reliques d’arbres forestiers peuvent également y être retrouvées (Milletia lorentii, Terminalia superba, T. catapa, Vernonia amygdalina, Trema orientalis, etc), ce qui témoigne du développement antérieur de forêt primaire voire secondaire sur le site. De plus, beaucoup d’espèces pionnières (Parinari excelsa, Panicum maximum, Tridax procumbens), envahissant souvent les espaces défrichés et transformés en milieu de production vivrière, n’évoluent guère en phase de succession secondaire à cause d’une forte pression anthropique dans les environs de la ville.

Le matériel géologique de la ville de Kinshasa est composé des formations meubles de recouvrement (alluvions, dépôts sablonneux d'âge pléistocène et pliocène) et quelques grès polymorphes et tendres de recouvrement, alors que le sol est dominé par une couverture sablonneuse de type Kalahari (Baert et al., 1991). Le climat de la ville de Kinshasa et ses environs appartient au climat tropical humide (Aw4) selon la

II.2.2. Production du broyat

Deux essences constituent la base de traitements : L. leucocephala et T. orientalis. Des rameaux et des disques du tronc ont été récoltés en janvier 2011 sur cinq individus de chaque espèce, lesquels étaient disséminés sur différents sites de la ville. Le diamètre maximal à la base des rameaux était de 6 cm pour le Leucaena et 5 cm pour le Trema, alors que celui du disque de tronc était de 22 cm pour le Leucaena et 19 cm pour le Trema. Le niveau de taille convenable des disques de tronc a été de 0,75 m au-dessus du sol (Kamabu et Lejoly, 1994). Le bois a été par la suite fragmenté dans une déchiqueteuse afin d’obtenir des broyats de petite taille. La fragmentation a concerné uniquement le bois après retrait de l’écorce en ce qui concerne le bois de tronc. Par ailleurs, toutes les branches choisies pour l’étude étaient considérées comme BRF à cause de leur diamètre qui était soit inférieur, soit égal à 7 cm. Les altitudes maximale et minimale des sites de récolte étaient 396 et 307 m, respectivement.

Les broyats ont été ensuite fragmentés à l’aide d’un broyeur à marteaux avec une grille assez large (3 à 4 mm d'ouverture). Le produit du broyage a été à nouveau broyé en utilisant une grille plus fine (1mm) et tamisé sur un tamis à secousses. Seule la fraction comprise entre 40 et 60 mesh a été conservée dans un sac de polythène qui a été soigneusement fermé aussitôt après le tamissage. Une quantité de 50 g de broyat tamisé était nécessaire pour analyser chimiquement tous les indices.

Avant de procéder aux analyses proprement dites, le prélèvement de l’humidité (moyenne de deux échantillons de 2 à 3 grammes), après stabilisation (8 jours) des échantillons, est donc indispensable en supposant qu’ils la conserveront durant toute la période desdites analyses (Sun et al., 2010).

Le test de Student a été fait sur les résultats d’analyse élémentaire du bois de tronc, le bois de branches ne faisant pas partie parce qu’étant analysé après constitution d’échantillons composites.

II.2.3. Extraction du broyat

L’extraction du broyat a été effectuée en deux étapes ; le broyat a d'abord été extrait au mélange éthanol anhydre-toluène puis, après séchage à l'air, à l'eau chaude (Stevanovic et Perrin, 2009). Dans chaque cas la détermination quantitative du pourcentage d'extractibles a été effectuée sur une fraction du broyat.

- L’extraction au mélange éthanol-toluène (mélange azéotropique de l’alcool éthylique anhydre et du toluène en proportions de 1 litre d’alcool éthylique anhydre et 427 ml de toluène) a été effectuée, de façon continue, dans un soxhlet et après pesée de 20 à 25 g de broyat dans un bécher (600 ml). Une fois terminée, le broyat a été séché à l’air et conservé dans un sac en polythène pour la détermination de l’humidité après stabilisation. L’évaporation du solvant contenu dans le ballon a été opérée à l'aide d’un rotavapor sous vide pour obtenir l'extrait sec. L’analyse s’est terminée par l’étuvage du ballon à 102°C pendant 12 heures, à l’issu duquel le pourcentage d'extractibles au mélange éthanol-toluène par rapport au bois initial a été déterminé.

- L’extraction à l'eau chaude a consisté à mettre environ 2 g de broyat, pesé à 0,1 mg, dans un ballon de 250 ml et à introduire 100 ml d'eau distillée dans un chauffe-ballon sous réfrigérant à reflux. Après 3 heures d'ébullition, le contenu du ballon a été filtré sur un creuset filtrant de porosité C, préalablement taré et lavé par la suite avec 1 litre d'eau chaude. Le creuset a été séché à l'étuve à 102oC pendant 24 heures, puis le broyat extrait a été pesé afin de déterminer le pourcentage d'extractibles à l'eau chaude par rapport au bois initial sec. L'extraction du restant de broyat a été séché seulement à l'air afin d’en déterminer, comme précédemment, l'humidité.

II.2.4. Détermination de la lignine

La détermination de la lignine a été réalisée d’après la méthode lignine Klason modifiée (Stevanovic et Perrin, 2009). Elle procède par pesée (précision oblige), dans une éprouvette de 16 x 100 mm, 225 à 250 mg de broyat extrait lequel a été recouvert avec 3 ml de H2SO4 72 %. Après imprégnation à l’aide d’une tige de verre, l’éprouvette a été

placée dans un bain à température contrôlée (30°C) pendant une heure. Le contenu de l’éprouvette a été ensuite transféré dans un erlenmeyer de 500 ml en utilisant 84 ml d’eau déminéralisée. Avant son transfert dans l’autoclave (pendant une heure à 125°C), l’erlenmeyer de 500 ml a été recouvert d’un autre mais plus petit (50 ml). Le filtrage de la lignine sur creuset intervient après refroidissement des échantillons. La lignine a été par la suite lavée à l’eau déminéralisée jusqu’à l’obtention d’un pH neutre. Enfin, la lignine a été séchée à l’étuve à 103oC jusqu’à constance de poids.

Le pourcentage en lignine a été calculé à l’aide de l’équation ci-après : Lignine (%) = _{𝑀𝑎𝑠𝑠𝑒 𝑎𝑛ℎ𝑦𝑑𝑟𝑒 𝑑𝑒 𝑠𝑐𝑖𝑢𝑟𝑒}𝑀𝑎𝑠𝑠𝑒 𝑑𝑒 𝑙𝑖𝑔𝑛𝑖𝑛𝑒 x100

La lignine soluble à l’acide a été mesurée par spectrophotométrie sur filtrat en introduisant, d’abord à la pipette, 1ml de filtrat concentré dans une éprouvette de 16 x 150 mm auquel 15 ml de H2SO4 à 4 % a été ajouté. L’absorbance de la solution a été

enfin mesurée à 205 nm en utilisant une cuvette en quartz et H2SO4 à 4 % comme

solution de référence. Il est à noter que la détermination de la lignine a été réalisée sur la sciure (ou broyat) extraite au préalable successivement au mélange éthanol-toluène et à l’eau chaude.

La formule suivante permet la détermination de la concentration en lignine : Filtrat non-dilué : Lignine (𝑔 𝑙⁄ )𝑐₌ 𝐴 110 où A = l’absorbance Filtrat dilué : _{Lignine (𝑔 𝑙⁄ )}𝑐₌ 𝐴 110× 𝐷 où D = 𝑉 𝑓𝑖𝑛𝑎𝑙 𝑉 𝑖𝑛𝑖𝑡𝑖𝑎𝑙

En tenant compte du volume du substrat et de la masse sèche de la sciure analysée :

L a.s = _{1000((𝑀𝑜)(100 100−𝑒))}𝐶.𝑉.100_⁄

Où L a.s = concentration de la lignine soluble dans l’acide du broyat sec non-extrait, % C = concentration de la lignine dans le filtrat, g/l

V = volume total du filtrat (87 ml), ml Mo = masse anhydre du broyat extrait, g

e = pourcentage d’extraits contenus dans le broyat, %

II.2.5. Détermination en composants organiques par Py-GC-MS

La pyrolyse combinée à la chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse (Py-GC/MS) est une méthode analytique utilisée pour dégrader thermiquement un échantillon organique afin de séparer et d’identifier ses fragments (Sun et al., 2010).

Les échantillons ont été pyrolysés à 550ºC sous hélium en utilisant un pyrolyseur Pyroprobe 2000 (CDS analytique, Inc), couplé à un chromatographe en phase gazeuse (Varian CP 3800) et un spectromètre de masse (Varian Saturn 2200 MS / MS, 30-650 uma). Le débit du gaz vecteur est de 1,0 ml / min et l’interface de pyrolyse et de l'injecteur GC ont été maintenus à 250º C. Les produits de pyrolyse ont été séparés sur une colonne capillaire FactorFour Varian (VF - 5 ms, 30 m x 0,25 mm x 0,25 μm). La pyrolyse a été réalisée à partir de 250º C (tenue 10 s) jusqu’à la température de pyrolyse (tenue 30 s) avec une vitesse de chauffage de 6ºC/ms. Le four GC a été maintenu d’abord à 45 °C pendant 4 min, puis chauffé à 280º C à raison de 4 ºC/min. La température finale est maintenue pendant 15 min. Le spectromètre de masse a été utilisé en mode impact électronique avec une énergie de 70 eV et la gamme de masse m/z 35 – 450.35 – 450. (Sun et al., 2010).

Les composés ont été identifiés en comparant les spectres de masse obtenus avec ceux de la librairie Wiley et des bibliothèques informatiques du NIST ainsi que ceux rapportés dans la littérature (Sun et al., 2010 ; Faix et al., 1990 et 1991).

II.2.6. Détermination de la cellulose

Le broyat a été soumis à l’attaque d’un mélange d’acide acétique et d’éthanol afin de transformer la lignine en produits nitrophénoliques, solubles dans l’alcool et insolubles dans l’eau. Les hémicelluloses ont été quant à elles hydrolysées en grande partie, dégradées et ont passé en solution (Stevanovic et Perrin, 2009). Environ 1g de broyat (pesé à 0,1 mg près) a été introduit dans l’erlenmeyer de 250 ml. Ensuite 15 ml de HNO3 ont été placés dans un bécher de 100 ml suivi rapidement de 60 ml d’alcool,

préalablement mesuré dans l’éprouvette graduée. Le tout a été versé rapidement dans l’erlenmeyer à col rodé contenant du broyat de bois. Le mélange a été porté dans un bain-marie avec réfrigérant à reflux tout en remuant doucement le ballon le plus fréquemment au début de l’ébullition. Après 1 heure d’ébullition, le contenu du ballon a été filtré sur un creuset de porosité C préalablement taré et disposé sur la fiole à vide. Un mélange frais d'alcool (50 ml) et d'acide nitrique (10 ml HNO3 - 40 ml EtOH) a été

versé à 3 reprises dans un ballon. Finalement, un filtrage sous vide suivi du lavage avec soin du résidu, d’abord à l’éthanol puis à l’eau froide et enfin à l'eau chaude (environ 1 litre) ont été opérés. Après séchage à l'étuve à 102oC pendant 24 heures, le taux de cellulose par rapport au bois sec a été déterminé. La moyenne de deux essais a été obtenue. L’indice de cellulose a été déterminé d’après la méthode de Kurschner et Hoffner (Stevanovic et Perrin, 2009). La détermination de cet indice a été réalisée à partir du broyat déjà extrait au préalable.

II.2.7. Détermination des pentosanes

Les hémicelluloses ont été déterminées à partir de la norme CPPA-G-12 (Stevanovic et Perrin, 2009) qui consiste à soumettre le broyat à l’attaque de l’acide chlorhydrique concentré (azéotrope à 131 +/- 0,5 g/l) et de doser le furfural obtenu par action de la dinitro-2-4-phénylhydrazine (DPNH) sur le groupement aldéhyde. Par pesée de l’hydrazone formée, il a été possible de remonter au poids du furfural et en tenant compte du rendement en furfural, au taux de pentosanes, également appelé indice de furfural. 300 à 500 g de broyat ont été pesés (à 0,1 g près) dans un ballon de 250 ml dans lequel quelques grains de pierre ponce et 120 ml d'acide chlorhydrique concentré à 131 g/l ont été placés. Le ballon a été posé sur le dispositif à pentosanes tout en

introduisant 30 ml d'acide chlorhydrique concentré à 131 g/l dans la fiole à décanter, le robinet de cette dernière étant fermé. Le mélange a été porté à ébullition pendant 10 minutes afin d’en recueillir environ 30 ml de distillat. Quelques gouttes ont été décantées du contenu de la fiole pour y remettre à nouveau 30 ml d’acide dans la fiole à décanter et poursuivre l’expérience jusqu’à atteindre 270 ml de distillat. Après avoir transvasé le contenu de l’éprouvette dans un bécher de 600 ml et rincé l’éprouvette avec l’acide chlorhydrique 2N, 150 ml de DNPH filtré sur creuset F ont été ajoutés tout en frottant les parois et laisser reposer pendant 18 heures. Le creuset de porosité F, préalablement taré, a été disposé sur la fiole à vide afin de laisser passer le contenu du bécher avec le minimum de vide possible. Le précipité a été lavé avec 50 ml d’une solution d'acide chlorhydrique 2N (dissolution de l'excès de DNPH), puis à l'eau jusqu'à disparition des ions Cl- (test négatif à AgNO3). Enfin un séchage à l'étuve à 102oC

pendant 24 heures a été opéré avant de peser et déterminer le taux de pentosanes par rapport au bois sec (moyenne de 2 essais).

Le poids de furfural est donné par la formule :

Masse de furfural = masse du précipité x 0,348

L’équivalence au taux de pentosanes est obtenue par usage d’un rendement moyen de 80,5 % pour le furfural (88,4 % pour les xylanes et 74,3 % pour les arabanes). D'où : Masse de pentosanes = masse de furfural x 1,71

II.2.8. Détermination de la composition élémentaire II.2.8.1. Minéraux dans le bois de tiges et des branches

Les minéraux qui ont été caractérisés sont le phosphore (P), le magnésium (Mg), le fer (Fe) le sodium (Na), le potassium (K), le manganèse (Mn) et le calcium (Ca). La méthode employée pour déterminer leur concentration dans le bois a été une digestion complète assistée aux micro-ondes dans une bombe de téflon à l’aide d’une solution acide (nitrique, chlorhydrique et fluorhydrique), suivi par une analyse élémentaire. La méthode d’atomisation choisie était le chauffage dans un plasma à couplage inductif (ICP) et la méthode de détection était la spectroscopie par émission atomique (AES). Le

tout s’est fait sur un appareil optima 4300 DV (Perkin Elmer) équipé d’un nébuliseur de type Scott (Stevanovic et Perrin, 2009).

II. 2.8.2 Composition élémentaire des échantillons des bois et des branches

La caractérisation des échantillons du bois et des branches selon leur composition en éléments organiques a aussi été faite. Un analyseur élémentaire PerkinElmer 2400 étalonné à l’acétanilide a permis de mesurer les concentrations de carbone, d’hydrogène et d’azote des échantillons du bois et des branches. L’appareil, en mettant en conditions réactionnelles de la matière organique et en quantifiant certains composés issus de réactions spécifiques, donne une concentration directement en pourcentage massique des éléments carbone (C), hydrogène (H) et azote (N). En combinant ces données avec la quantité de cendre préalablement mesurée et en supposant que tous les constituants des fibres sont composés soit de carbone, d’hydrogène, d’azote, d’oxygène ou de minéraux, il serait possible de calculer approximativement le pourcentage massique d’oxygène des échantillons de bois et d’écorce. Ce pourcentage est obtenu par l’équation suivante :

O% = 100% - C% - H% - N% - Cendres%.

Pour les besoins de la présente recherche les teneurs en carbone et en azote ont été utilisés pour les calculs des ratios importants.

II.2.9. Détermination des cendres

L’analyse des cendres a été réalisée d’après la méthode dite standard pour cendres ou D 1102 – 84 qui consiste à déterminer le pourcentage de résidus restant après oxydation sèche (c’est-à-dire une oxydation à 580 - 600°C) du broyat du bois (ASTM International, 1984).

En premier lieu, il a été question de tarer 3 creusets en porcelaine à 0,1mg près à placer à l’étuve à 103oC. Le dessiccateur a été utilisé pour refroidir les creusets pendant 20 min environ avant d’effectuer les pesées. Ensuite environ 2 g de broyat non extrait ont été

introduits dans chaque creuset pour en déterminer l’humidité et calculer ainsi la masse sèche. Les creusets ont été placés au four à moufles dont la montée de la température (jusqu’à 600°C) en 2 heures a été opérée automatiquement par un programme. Cette température a été maintenue pendant 6 heures pour descendre à 103oC pendant 2 heures. Les creusets ont été placés par la suite dans un dessiccateur. Une fois refroidis, les creusets ont été pesés (à 0,1 mg près) pour obtenir le taux de cendres, en pourcentage, par rapport à la masse anhydre initiale du broyat non extrait.