Matériel et méthode

A validação é uma etapa essencial no desenvolvimento da metodologia analítica, pois é ela quem vai definir se o método é viável ou não para o objetivo pretendido (RIBANI et al., 2004; LANÇAS, 2009), por meio de critérios de aceitação preconizados (INMETRO, 2007; ANVISA, 2017; MAPA, 2011). A validação é essencial para obter resultados confiáveis que possam ser satisfatoriamente interpretados (BRITO et al., 2003). Os parâmetros analíticos, também conhecidos como parâmetros de desempenho analítico, características de desempenho ou figuras analíticas de mérito, normalmente determinados na validação de métodos de separação por cromatografia são: linearidade, limite de detecção (LD), limite de quantificação (LQ), precisão e exatidão (ANVISA, 2017; RIBANI et al., 2004; LANÇAS, 2009; MAPA, 2011; INMETRO, 2011). Esses parâmetros foram avaliados neste trabalho.

4.8.1. Curva de calibração e linearidade

A linearidade de um método pode ser observada pelo gráfico dos resultados dos ensaios em função da concentração do analito ou calculados a partir da equação da regressão linear (Equação 1), determinada pelo método dos mínimos quadrados (INMETRO, 2007). Ela é avaliada por meio de uma curva de calibração. Recomenda-se que esta curva seja construída por, no mínimo, cinco níveis de concentração, além disso, a curva de calibração pode ser construída pelos seguintes métodos: padronização externa, padronização interna, superposição de matriz ou adição de padrão (ANVISA, 2017; RIBANI et al., 2004; INMETRO, 2011).

𝑦 = 𝑎𝑥 + 𝑏 Equação 1

Onde:

𝑦 = sinal analítico (absorbância, altura ou área do pico, etc.); 𝑥 = concentração do analito;

𝑎 = coeficiente angular; 𝑏 = coeficiente linear.

Além dos coeficientes de regressão a e b, também é possível calcular o coeficiente de correlação linear (R). Este coeficiente (R) permite uma estimativa da qualidade da curva obtida, ou seja, quanto mais próximo do valor 1,0, menor a dispersão do conjunto de pontos experimentais e menor a incerteza dos coeficientes de regressão estimados.

Visando avaliar a qualidade e, consequentemente, a validade da equação de regressão linear, como coeficiente de variação explicada pelo modelo (r2), coeficiente de correlação (r) e significância estatística do modelo de regressão (Fcalculado), fez-se a Análise de Variância (ANOVA).

Também, aplicou-se o teste t de Student visando avaliar a significância estatística dos coeficientes angular e linear da equação da reta obtida (RIBANI et al., 2004). Um coeficiente angular significativo indica que a curva de calibração do método apresenta sensibilidade adequada. Quando o coeficiente linear não é significativo, indica que o mesmo pode ser desconsiderado da equação da curva e essa pode assumir a forma y = a.x. Os cálculos de significância para o coeficiente linear e angular podem ser feitos de acordo com as Equações 2 e 3, respectivamente.

tcalc= b sb Equação 2 tcalc= a sa Equação 3 Onde:

sb e sa= desvio padrão da resposta analítica respectiva;

b = coeficiente linear da curva de calibração; a = coeficiente angular da curva de calibração.

Os desvios padrão da inclinação (sa) e do intercepto (sb) foram obtidos

utilizando a ferramenta PROJ. LIN do Software Microsoft Excel®.

Os valores de tcalc foram comparados com os valores de ttab para um nível se

confiança de 95%. O número de graus de liberdade (ν) foi igual a ν = p-2 (para um modelo linear), onde p é o número de níveis de concentração da calibração.

A fim de comprovar a significância das curvas analíticas, comparou-se o valor de Fcalc da mesma, com o valor de Fcrítico tabelado, no nível de confiança de 95 % de acordo com a Equação 4(PIMENTEL; NETO, 1996; NETO; SCARMINIO; BRUNS, 2010).

F=MQRegr MQ_Resid

Equação 4

Onde:

𝑀𝑄𝑅𝑒𝑔𝑟 = Média dos quadrados da regressão; 𝑀𝑄𝑅𝑒𝑠𝑖𝑑 = Média dos quadrados do resíduo.

Se Fcalc ≥ Fcrítico, se aceita o nível de confiança estabelecido e, nesse caso, a regressão é significativa. Se Fcalc ≤ Fcrítico, não há indicação de existência de relação linear entre as variáveis x e y, nesse caso não tem sentido utilizar a regressão.

4.8.2. Limite de detecção (LD) e de quantificação (LQ)

O LD é a menor quantidade ou concentração do analito em exame na amostra que pode ser diferenciada, ou seja, detectada, mas não quantificada (ANVISA, 2017; INMETRO, 2007). Em análise de elementos traços, é de fundamental importância que seja conhecido a menor concentração que o método pode detectar (INMETRO, 2011). O LD pode ser calculado de três maneiras diferentes: método visual, método relação sinal- ruído, método baseado em parâmetros da curva analítica (RIBANI et al., 2004).

O LQ é definido como a menor concentração do analito que pode ser determinada com um nível aceitável de precisão e veracidade (INMETRO, 2007). Sendo expresso principalmente, para ensaios quantitativos, produto de degradação, o LQ é expresso como concentração do analito na amostra.

Neste trabalho foi utilizado o método baseado em parâmetros da curva analítica. Neste método o LD pode ser expresso pela Equação 5 e o LQ pela Equação 6:

LD=3,3 x DP S

Equação 5

Onde:

S = coeficiente angular da equação da reta.

O LQ pode ser expresso a partir da Equação 6:

LQ = 10 x DP S

Equação 6

Onde:

DP = estimativa do desvio padrão da resposta dos brancos. S = coeficiente angular da equação da reta.

Para calcular os parâmetros da curva e a estimativa do desvio padrão relativo destes parâmetros foi utilizado o Software Microsoft Excel®.

4.8.3. Precisão

A precisão de um método analítico representa o grau de concordância entre resultados de testes individuais de análises repetidas de uma amostra (ANVISA, 2017). As três maneiras de expressá-la são por meio da repetitividade, precisão intermediária e reprodutibilidade. As duas primeiras são expressas pelo desvio-padrão (s) e desvio- padrão relativo (DPR) ou coeficiente de variação (CV) (INMETRO, 2011). Já esta última somente pode ser estimada mediante a participação de um ensaio interlaboratorial colaborativo, geralmente não disponível (MAPA, 2011).

Nesta pesquisa foi realizada a repetitividade para o cálculo da precisão. Por se tratar de uma análise cromatográfica é importante conhecer a repetibilidade de pelo menos dois parâmetros: o TR (usada para confirmar a identidade do composto – análise qualitativa) e a área do pico (parâmetro utilizado na quantificação dos compostos de interesse – análise quantitativa) (LANÇAS, 2004). A precisão foi estimada por meio do DPR, também conhecida como CV (Equação 7).

CV=DP

x x 100

Equação 7

Onde:

DP = estimativa do desvio padrão das medidas; x= concentração média;

4.8.4. Recuperação

O Padrão Surrogate (PS) é uma substância que possui características físicas e químicas semelhantes as dos analitos de interesse, pois ele deve simular a dinâmica desse composto no ambiente. Para tanto, é necessário garantir que o PS não esteja presente na amostra analisada, assim escolheu-se para este trabalho PS deuterados, pois são substâncias que não são encontradas naturalmente no ambiente (SILVA et al., 2017; RIBANI et al., 2004).

O PS é um método de recuperação utilizado na ausência de Material de Referência Certificado (MRC) (RIBANI et al., 2004). Serve para avaliar a eficiência do

método de extração a partir da relação entre a quantidade de padrão obtida no final dos processos e a adicionada no começo da extração (fator de recuperação) (LANÇAS, 2004).

Para o controle nas análises, antes da extração, as amostras e os brancos são dopados com 50 µL de PS de HPAs, que apesar de não serem da mesma classe química dos compostos estudados, possuem valores de Kow e Koc e tempo de retenção próximos aos dos analitos investigados.