Matériel et Méthodes

2-1- Enquête CAP (Connaissance, Attitude, Pratique) l’utilisation des moustiquaires imprégnées d’insecticides à longue durée d’action.

L’enquête CAP (Connaissance, Aptitude, Pratique) a pris en compte les patients venus à l'hôpital de zone et qui faisaient le paludisme à la suite des tests diagnostics.

Les parents de 200 patients des deux sexes de 0-5 ans ont été soumis à un questionnaire quantitatif et qualitatif.

Le questionnaire a porté, entre autres, a) sur la possession ou non de MILD, b) l’utilisation ou non de ces MILDs comme moyen de protection, c) les lieux d’achat, d) l’importance des MILD, d) les autres le terrain et sur des entretiens individuels et collectifs (groupes de parde).

L’objectif de ce questionnaire suivi du focus group organisé a permis d’avoir une idée sur la perception qu’ont les populations de Comè sur les MILDs.

2-2. Diagnostic biologique

2-2-1. la goutte épaisse – le frottis sanguin

Le diagnostic de certitude du paludisme est apporté par la mise en évidence du parasite dans le sang. Dans le cadre de notre étude, c’est le diagnostic direct qui a été utilisé. Il se réalise par l'examen direct au microscope optique de prélèvements sanguins effectués de préférence avant tout traitement antipaludique, au moment des pics fébriles. Les techniques les plus utilisées ont été la goutte épaisse et le frottis sanguins.

 la goutte épaisse est une technique de concentration des parasites.

L'examen se fait au microscope optique, à l'objectif X100 en utilisant de l'huile à immersion. La numération se fait en comptant les parasites rapportés au nombre de leucocytes. L'examen peut mettre en évidence de faibles taux de parasitémie.

 Le frottis sanguin qui est l'étalement mince d'une goutte de sang prélevée au doigt sur une lame de verre. L'examen se fait après fixation à l'alcool et coloration au Giemsa. Il permet un diagnostic d'espèce plus précis mais ne permet pas de dépister des parasitémies faibles.

L'endémicité palustre a été évaluée par des mesures de la prévalence parasitaire effectuées au cours de la période d’étude. A chaque passage un tri aléatoire a été fait sur l'échantillon à partir duquel, un prélèvement sanguin au niveau de la pulpe du doigt pour la réalisation de frottis et de gouttes épaisses a été fait. Le taux de portage parasitaire a été estimé par la proportion de gouttes épaisses (GE) positives parmi le nombre de GE examinées. Les charges parasitaires des formes sexuées et asexuées ont été exprimées en nombre moyen de parasites par micro litre de sang.

2-2-2- Etude de la morbidité palustre.

La morbidité palustre a été évaluée ici en prenant pour cible toute personne notamment les enfants de moins de cinq ans et les femmes enceintes se présentant au poste de santé pour consultation avec des signes évocateurs de paludisme (hyperthermie, céphalée, arthralgies, troubles digestifs,). Des prélèvements de sang ont été effectués pour la confection d'étalements (frottis et GE) en vue de déceler la présence d'hématozoaires, ceci afin d'évaluer la morbidité palustre.

Toutes les lames confectionnées ont été colorées et lues quotidiennement durant toute la durée des travaux.

Pour atteindre ces objectifs parasitologiques ci-dessus citées, le travail a consisté à prélever et à analyser des échantillons prélevés chez les patients reçus à l'hôpital de zone et qui faisaient le paludisme durant la période de stage.

 Procéder à un prélèvement capillaire ;

 Réaliser rapidement une goutte épaisse et un frottis sanguin à partir du prélèvement capillaire et les identifier;

 Apres séchage, colorer les lames au GIEMSA après avoir fixé les frottis ;

 laisser sécher et observer au microscope à l’objectif X100.

2-2-3. Confection des lames de sang(Réalisation de la goutte épaisse et du frottis sanguin)

* Collecte pour Goutte Epaisse et Frottis mince

▪ Matériel

Lames porte-objet rigoureusement propres Lancettes stériles

Coton hydrophile Alcool à 70°

Lames à bords rodés ou lamelles Tubes EDTA

▪ -Sang capillaire obtenu par ponction capillaire au bout du doigt - Etiqueter les lames porte-objet rigoureusement propres

- Ne pas toucher la surface de la lame où l’échantillon de sang sera déposé

- Sélectionner le doigt à piquer, le majeur ou l’annulaire ; pour les nourrissons, le prélèvement se fait au niveau du talon.

- Nettoyer la partie à piquer avec de l’alcool à 70°, laisser sécher.

- Piquer le bout du doigt ou le talon pour le nourrisson.

- Essuyer la première goutte de sang avec un morceau de compresse-gaze propre.

- Presser doucement le doigt et recueillir au milieu de la lame une petite goutte de sang égale à 2,5µl de sang qui servira à faire le frottis.

- Presser à nouveau le doigt pour faire sortir plus de sang et recueillir à environ 1cm de la goutte précédente deux ou trois gouttes égales à 5 µl de sang qui servira à réaliser la goutte épaisse.

- Essuyer le reste du sang sur le bout du doigt avec de la compresse ou du coton sec.

▪ - Sang veineux obtenu par ponction veineuse

Le sang est prélevé dans un tube contenant un anticoagulant (EDTA de

préférence) préalablement identifié

* Confection Goutte Epaisse et Frottis mince ▪ Frottis mince

- Utiliser une lame à bord rodé ou une lamelle pour étaler ; tenir la lamelle dans un angle de 45° et la mettre en contact avec la goutte de sang prévue pour le frottis sanguin.

- Attendre que le sang se répande sur la largeur de la lamelle puis faire glisser délicatement et très rapidement en avant.

- Réaliser un frottis mince de façon à pouvoir lire un imprimé à travers le frottis.

- Laisser sécher et fixer au méthanol.

Figure 6 : Confection d’un frottis mince ▪ Goutte Epaisse

- Laisser sécher convenablement et passer à la déshémoglobinisassions à l’eau simple pendant 3mn.

- Attendre que le frottis et la goutte épaisse réalisés sur la même lame soient totalement secs avant de passer à la coloration.

Figure 7: Confection d'une goutte épaisse

* Coloration Goutte Epaisse et Frottis mince

Le colorant de GIEMSA est recommandé pour la détection et l’identification des parasites du paludisme. Il est possible d’acheter le colorant de GIEMSA ; mais la formulation ci-dessous rend les résultats plus constants et la solution n’expire pas :

Perles de verre 3.0 mm 30 ml Méthanol, sans acétone 270 ml Poudre de GIEMSA (certifiée) 3.0 g Glycérol 140 ml

- Mettre les perles de verres et les autres ingrédients dans un flacon en verre brun de 500 ml dans l’ordre indiqué. Boucher le flacon.

- Placer le flacon dans un angle sur un agitateur et agiter légèrement pendant 30 à 60 minutes par jour pendant au moins 14 jours. Le colorant est stable à

température ambiante indéfiniment si le flacon est maintenu hermétiquement fermé et sans humidité ; (il s’améliore avec l’âge).

Le colorant de GIEMSA est un mélange d’éosine (qui colore en rose), d’azur (colorant neutre) et de bleu de méthylène (colorant basique). Il est fourni sous forme d’une solution mère commercialisée en flacons de 100 ml,250 ml, 500 ml.

Pour la coloration des lames confectionnées deux méthodes de dilution du GIEMSA sont proposées :

- La méthode classique qui utilise le colorant de GIEMSA à 3% et - La méthode rapide qui utilise le colorant de GIEMSA à 10%.

Dans le cadre de notre étude, le colorant de GIEMSA à 10% (10 ml de solution-mère de GIEMSA pour 90 ml d’eau tamponnée à pH 7,2) a été utilisé.

* Observation et lecture des lames colorées au microscope

Une fois les lames colorées et séchées, la lecture au microscope se fait à l’objectif X100 pour la recherche et l’identification des plasmodies après avoir déposé une goutte d’huile à immersion sur la goutte épaisse et le frottis. On examine la lame tout en recherchant également les différents stades évolutifs du Plasmodium et on procède enfin à la détermination de la densité parasitaire.

* Détermination de la Densité parasitaire

Elle consiste à dénombrer les parasites par microlitre de sang. Il faut noter que le comptage des leucocytes et des trophozoïtes reste simultané. La Densité Parasitaire (DP) se calcule à partir de la formule suivante et est exprimée en Parasite par microlite de sang (P/µl).

 Par contre à 200 leucocytes, si le nombre de parasite compté est inférieur à 100, il faut alors continuer jusqu’à 500 leucocytes.

 Si après lecture de 500 leucocytes, aucun parasite n’est rencontré, la lame est déclarée négative. Les résultats obtenus sont exprimés en fonction de la présence ou non de trophozoïtes. Dans le cas où des trophozoïtes ont été dénombrés, la charge parasitaire est à préciser.

CHAPITRE III :