1.1 Insectes
1.1.1 Élevage de Sitophilus oryzae
Les charançons du riz, S. oryzae, sont élevés en incubateur à 27.5°C et à un taux d’humidité de 70%. Les souches sensibles (WAA42) sont nourries exclusivement sur grains de blé, alors que les souches tantes (IsoR3) sont élevées sur graines de pois afin de maintenir la résis-tance à PA1b. Les tests de toxicité sont réalisés sur un lot de 30 insectes adultes, âgés de 7 à 21 jours après émergence de la graine. Les insectes sont alimentés par un milieu artificiel sous forme de boulette qui est co m-posé d’un mélange farine de blé/eau (250 mg/167 µl) et de la toxine à te s-ter. Le milieu témoin positif de toxicité est composé de 50 mg de farine de pois (Pisum sativum) et de 200 mg de farine de blé. Le nombre d’insectes morts est dénombré quotidiennement sur une période de 15 jours.
1.1.2 Élevage de Tribolium castaneum
T. castaneum, le coléoptère rouge de la farine, est élevé dans les mêmes conditions que S. oryzae. Ils sont nourris par un mélange de 95% de farine de blé et de 5% d’extrait de levure. Pour les tests de toxicité, 30 insectes adultes (âgés entre 2 et 4 semaines après émergence), sont nourris sur le milieu artificiel auquel est ajouté la toxine à tester, et la mortalité est relevée quotidiennement.
1.2 Matériel végétal
1.2.1 Nicotiana sp.
Pour les cinq espèces de Nicotiana utilisées (N. benthamiana, N. glauca, N. rustica, N. suaveolence, et N. tabacum), les graines nous ont été données gracieusement par le jardin botanique du Parc de la Tête d’Or de la ville de Lyon. Elles sont cultivées en serre avec une photopériode de 16 h, et une température de 24°C jour et 21°C nuit. Les jeunes plants de tabac sont utilisés pour l’expression transitoire entre huit et dix semaines après semis.
1.3 Souches bactériennes et milieux de cultures
1.3.1 Escherichia coli
Les souches bacteriennes DH5α et TOP10 (Subcloning efficienty competent cells, Invitrogen, St Aubin, France) sont utilisées pour les clonages plasmidiques, pour l’amplification et le stockage des plasmides. Elles sont présentées dans le tableau n°1. Ces bactéries sont cultivées à 37°C, (agitation 220 rpm pour les cultures liquides) en milieu LB ( Luria-Bertani: bacto peptone 10 g.L-1, yeast extract 5 g.L-1 et NaCl 5 g.L-1) additionné ou non d’agar (15 g.L-1). Les antibiotiques sont utilisés aux concentrations finales de 100 mg.L-1 d’ampiciline, de 50 mg.L-1 de kana-mycine, 20 mg.L-1 de gentamycine, et 50 mg.L-1 de rifampicine en fonc-tion des résistances des différentes souches cultivées.
1.3.2 Agrobacterium tumefaciens
La souche C58pMP90 [KONCZ '86] permet de transformer effi-cacement les cellules végétales de N. benthamiana. Elle est utilisée pour l’étape d’agro-infiltration dans l’expression transitoire de protéines. La souche p19 [VOINNET '03] est la même bactérie déjà transformée par le
vecteur pBIN61-p19. Ce vecteur permet l’expression d’une protéine virale (p19) connue pour être un suppresseur de silencing.
Bactéries Souche Génotype Résistance aux antibiotiques
Escherichia
coli DH5α
F- Φ80lacZΔM15 Δ(lacZYA-argF) U169
recA1 endA1 hsdR17(rk-, mk+) phoA
supE44 thi-1 gyrA96 relA1 λ
aucune
Escherichia
coli TOP10
F- mcrA Δ( mrr-hsdRMS-mcrBC) Φ80lacZΔM15 Δ lacX74 recA1 araD139
Δ( araleu)7697 galU galK
streptomycine
Agrobacterium
tumefaciens C58 pMP90 (Koncz et Schell, 1986)
rifampicine, gentamicine
Tableau n°1. Souches bactériennes utilisées lors des travaux décrits dans ce mé-moire.
1 Stade 2 Stade 3 Stade 4 Stade 5
1.4 Souches de levure
Saccharomyces cerevisiae est une espèce de levure fréquemment utilisée en tant que modèle eucaryote. Son génome est entièrement sé-quencé. Il existe des souches de levures mutées pour de très nombreux gènes, qu’il est possible de se procurer via le site Euroscarf (http://web.uni-frankfurt.de/fb15/mikro/euroscarf/). Pour ce travail, nous avons utilisé différentes souches (tableau n°2) dont les gènes codant pour les protéines des sous-unités c, d et e du complexe Vo de V-ATPase sont éteints, nommés respectivement VMA3, VMA6 et VMA9 chez la levure. Ce sont des souches haploïdes dont le cadre de lecture du gène muté est rem-placé par un gène qui confère à la souche mutée une résistance à la kana-mycine. Bien que viable, la perte d’un gène important pour leur fonction-nement physiologique entraîne l’apparition de phénotypes altérés sous certaines conditions. Les caractères phénotypiques altérés utilisés dans ce travail sont présentés dans le tableau n°2. L’intégralité des phénotypes mutants sont présentés sur le site Saccharomices Genome Database (http://www.yeastgenome.org). Ces souches sont aussi déficientes pour
leur capacité à synthétiser l’histidine, la leucine, la méthionine et l’uracile. Elles sont cultivées à 27°C sur un milieu de culture sélectif (YNB 0,7%, glucose 2%, histidine, leucine, méthionine et uracile, en pré-sence ou non de 2% d’agar), ou sur du YPD lorsque aucune sélection n’est souhaitée.
Souche Gène d’accession Numéro Phénotype altéré Génotype
YEL027w VMA3 Y00268 Thermorésistance/ résistance au pH alcalin
BY4741; Mat a; his31; leu20; met150; ura30;
YEL027w::kanMX4 YLR447c VMA6 Y06051 Thermorésistance/ résistance au pH
alcalin
BY4741; Mat a; his31; leu20; met150; ura30;
YLR447c::kanMX4 YCL005w VMA9 Y03413 Thermorésistance/ résistance au pH
alcalin
BY4741; Mat a; his31; leu20; met150; ura30;
YCL005w::kanMX4
Tableau n°2. Souches de levure Saccharomyces cerevisiae utilisées lors de ce tra-vail et leurs caractéristiques.
1.5 Cellules de tissu ovarien de Spodoptera frugiperda (Sf9)
1.5.1 Culture des cellules SF9
La lignée cellulaire Sf9 est un clone dérivée de la lignée cellu-laire IPLB-Sf-21-AE. Ces cellules sont issues d’une lignée ovarienne de la chenille Spodoptera frugiperda.
Les cellules Sf9 sont cultivées dans un milieu composé principa-lement de milieu « Insect-XPRESS™ Protein-free Insect Cell Medium with L-glutamine » (Ozyme, Montigny le Bretonneux, France), additionné de 5% de sérum de veau fœtal (Fetal Bovine Serum, Carlsab, USA) et 0,1 % de gentamycine à 10 mg.ml-1 (Sigma, La chapelle-sur-Erdre, France) et ensemencées à raison de 200 000 cellules par flasques de 25 cm2
spécia-lement traitées pour faciliter leur adhésion au support (Nunc SoLo Flasks, Thermo Scientific, Villebon-sur-Yvette, France). Les cellules sont incu-bées à 27°C. Lorsque la concentration initiale est de 200 000 cellules par flasque, la confluence est atteinte en 8 jours. Les cellules sont repiquées toutes les semaines jusqu’au 30ème passage.
1.5.2 Tests de toxicité sur cellules Sf9
Les cellules Sf9 à environ 80% de confluence sont reprises dans 2 ml de milieu de culture et sont dénombrées à l’aide d’une cellule de Ma-lassez. Elles sont ensuite diluées pour obtenir une concentration entre 15 000 et 20 000 cellules par ml de milieu de culture. La toxine testée est diluée avec du milieu de culture et 100 µl par puits de solution de toxine sont déposés dans une plaque 96 puits, puis 20 µl de cellules. Chaque condition est répétée trois fois. Les cellules sont mises à incuber cinq heures à 27°C, et la viabilité des cellules est déterminée en utilisant le kit CellTiter-Blue® (Promega, Madison, USA). Pour cela, 20 µl de réactif CellTiter-Blue sont ajoutés dans chaque puits. Ce réactif contient de la Resazurin dont l’absorbance se mesure à 605 nm. Les cellules vivantes métabolisent ce composé en Resorufin dont l’absorbance se mesure à 573 nm. L’absorbance est mesurée en lecteur de plaque à 605 et 573 nm toutes les heures pendant 5 heures.