3.1 Expression hétérologue de PA1b par transformation transitoire de Nicotiana benthamiana
3.1.1 Transformation d’Agrobacterium tumefaciens par choc thermique
Les bactéries Agrobacterium tumefaciens souche C58 pMP90 sont rendues compétentes avant de pouvoir effectuer la transformation. Pour cela une culture de 50 ml de bactéries (LB/rifampicine 50 mg.L-1, une nuit à 27°C sous agitation douce), est centrifugée cinq minutes, 3000 g à 4°C. Le culot est resuspendu dans 1 ml de solution de CaCl2 20 mM. La solution bactérienne est aliquotée par 100 µl (quantité utilisée pour une transformation) et conservée à -80°C.
Un aliquot d’A. tumefaciens compétentes est décongelé douce-ment dans la glace. Après y avoir ajouté 5 µg d’ADN plasmidique (vec-teur pMDC32-séquence d’intérêt), le mélange est incubé 20 minutes dans la glace, sept minutes dans de l’azote liquide, puis 35 minutes à 37°C. Les bactéries sont ensuite mises en culture dans 10 ml de LB (1 nuit à 27°, sous agitation 220 rpm). La culture est ensuite centrifugée 15 minutes à 4000 g, et le culot est repris dans 300 µl de LB. Les bactéries sont ensuite étalées sur milieu sélectif (LB/rifampicine/kanamycine). La résistance à la rifampicine étant apportée par le vecteur pMDC32, seules les Agrobacté-ries ayant intégré le plasmide sont capables de pousser sur ce milieu.
3.1.2 Transformation transitoire de feuilles de N. benthamiana par infiltration
Une colonie d’A. tumefaciens transformée est mise en pré-culture (5 ml LB/rifampicine/kanamicine, 28°C, 24 h, 220 rpm), en même temps que la souche A. tumefaciens p19. A partir de ces pré-cultures, les diffé-rentes souches sont mises en culture de 50 ml en Erlenmeyer (LB/rifampicine/kanamicine, 28°C, 24 h, 220 rpm). La D0600 des cultures bactériennes est mesurée, et est ramenée à 0,3 par dilution. Après deux
heures d’incubation (50 ml LB/rifampicine/kanamycine, 28°C, 220 rpm) les cultures bactériennes sont centrifugées (3500 rpm, 10 min) et lavées deux fois dans 10 ml de solution d’incubation (50 mM MES pH 5.6, NaH2PO4 2 mM, acétosyringone 100 µM, 0.5% de glucose). Les solu-tions d’Agrobactéries portant le vecteur pMDC32 et p19 sont mélangées dans les proportions 50/50 (v /v) et incubées au minimum deux heures. Ces solutions sont co-infiltrées dans les feuilles de N. benthamiana. Avec un embout pour pipette de 200 µL, la feuille est délicatement trouée, puis le milieu est injecté à l’aide d’une seringue sans aiguille de 2 ml, en bl o-quant l’autre côté de la feuille avec un doigt jusqu’à infiltration de la tota-lité de la feuille. Une fois infiltrés, les plants de tabac sont cultivés dans des conditions similaires aux tabacs non transformés. Après récolte, les feuilles sont conservées au congélateur à -80°C.
Les feuilles de tabac infiltrées, les feuilles non infiltrées, les tiges ou les racines de tabacs sont broyées au mortier et au pilon dans de l’azote liquide directement à la sortie du congélateur. Le broyage est répété trois fois. La suite de l’extraction et de la purification de PA1b est présentée en partie 5.1.
3.2 Complémentation fonctionnelle chez S. cerevisiae
3.2.1 Transformation de levure : méthode de l’acétate de lithium
Les souches de S. cerevisiae YEL027w, YLR447c et YCL005w sont cultivées en Erlen, dans 50 ml de milieu YNB sélectif, à 27°C sous agitation jusqu’à obtention d’une DO600 comprise entre 1et 2. Les solu-tions suivantes sont à préparer préalablement et à autoclaver : solution d’acétate de lithium 10X (1M de lithium acétate, le pH est ajusté avec de l’acide acétique à 7,5), solution TE (100 mM Tris-HCl pH 7,5 ; 10 mM EDTA pH 7,5) et une solution PEG (polyéthylène glycol 4000 50 % dans l’eau). Les cultures sont centrifugées à 3000 rpm, 5 min. Le culot est lavé avec 20 ml d’eau ultra-pure préalablement autoclavée. Après une nouvelle centrifugation, le culot est repris dans 250 µl de tampon d’acétate de l thium/TE/eau (1/1/8) (v/v/v) et des aliquots de 50 µl sont réalisés (quant i-té nécessaire pour une transformation). Pour chacune des transformations,
3 µl d’ADN carrier (single strand salmon sperm ADN 10 mg.ml-1, Sigma, France) sont ajoutés dans 50 µl de solution de levure, ainsi que l’ADN transformant (1 à 2 µg dans moins de 5 µl). L’ensemble est mélangé en tapotant légèrement le tube. 350 µl de mélange lithium d’acétate/TE/PEG dans les proportions 1/1/8 (v/v/v), sont ajoutés. La solution est mélangée par inversion et mise à incuber 30 minutes à 30°C, puis 20 minutes à 42°C. Le mélange est centrifugé à 15 000 rpm pendant une minute à tem-pérature ambiante. Le surnageant est éliminé, et les levures sont resuspe n-dues dans 100 µl de solution TE 1X. Elles sont ensuite étalées sur milieu sélectif en absence d’uracile et incubées à 27°C. Seules les levures ayant intégré le vecteur pYES2 sont capables de se développer.
3.2.2 Transformation de levure : méthode de l’électroporation
Les souches d’S. cerevisiae sont cultivés en Erlen, dans 50 ml de milieu YNB sélectif, à 27°C sous agitation jusqu’à obtention d’une DO600 comprise entre 0,6 et 1,2. Les cultures sont centrifugées (4000 rpm, 3 min) et le culot est lavé par 20 ml d’eau ultra-pure préalablement autoclavée et à nouveau centrifugées. Le culot est repris dans 5 ml de YPD contenant du DTT 25 mM, et du tampon HEPES 20 mM pH 8 et le tout est mis à incu-ber 30 minutes à 30°C. Une nouvelle centrifugation est réalisée (4000 rpm, 3 min), et le culot est repris dans 250 µl de tampon EP (10 mM de Tris-HCl pH 7,5 ; 270 mM de saccharose et 1 mM de MgCl2). Les cu-vettes d’électroporation stériles et du milieu YPD sont refroidies sur glace. Dans un tube Eppendorf, 100 à 200 ng (<2µl) d’ADN transformant sont mélangés avec 50 µl de culture de levure dans le tampon EP. Le mé-lange est transféré dans une cuvette d’électroporation qui est ensuite pla-cée dans l’électroporateur. Un courant de 1000 voltes est appliqué. On ajoute rapidement 1ml de YPD, et on transfère les levures dans un tube froid et stérile. Après 60 minutes d’incubation à 27°C, les levures sont étalées sur boite de Petri contenant un milieu sélectif, en absence d’uracile afin de sélectionner les souches ayant intégré le vecteur pYES2.
3.2.3 Expression de la protéine recombinante et test de complémentation fonctionnelle
Les souches utilisées, en raison de la suppression d’un des gènes codant pour une des sous-unités Vo de V-ATPase, ont perdu leur capacité à pousser sur un milieu alcalin (pH de 7,5), ou à température élevée (37°C). Les tests de complémentation sont réalisés sur milieu inductif so-lide, soit à une température de 37°C soit sur milieu alcalin (milieu sélec-tif ; galactose ; 50 mM de MOPS ; 50 mM de MES ; pH7,5). La croissance des levures est regardée quotidiennement pendant cinq jours. Les résultats sont interprétés par comparaison de croissance de souche mutée compl é-mentée par leur propre sous-unité par rapport à celle compléé-mentée par une sous-unité hétérologue.