Marquage chimique

Plusieurs stratégies d’étiquetage (tags) ont été développées par modification chimique des groupes fonctionnels de certains résidus d'acides aminés dans des protéines ou des peptides (Figure 7) :

52 Figure (7) Le marquage chimique de protéines.

ICAT et ICPL sont effectués avant la digestion des protéines. TMT, iTRAQ ou diméthyle sont effectués au niveau peptidique (le marquage par iTRAQ peut être réalisé avant la digestion au niveau protéique (Wiese et al., 2007)). Pour ICAT, ICPL et diméthyle, la masse du même peptide marqué est différente en mode MS tandis que la fragmentation du peptide marqué par TMT ou iTRAQ donne des fragments dits rapporteurs différents qui permettent la quantification de ce peptide dans des différents échantillons.

ICAT (Isotope-coded affinity tags) : Cette technique a été développée par Gygi et al. (Gygi

et al., 1999), deux échantillons sont marqués avec des tags chimiquement identiques qui ne

diffèrent que par leur composition isotopique (lourd et léger) et contiennent un groupement thiol-réactif (qui fait une liaison covalente avec le thiol de la cystéine comme l’iodoacétamide) et un groupement biotine pour faciliter la purification par affinité (Figure 8). Les échantillons sont mélangés, digérés, et les peptides marqués sont sélectivement enrichis par chromatographie d’affinité. Enfin, les peptides marqués ICAT sont quantifiés par spectrométrie de masse. Les peptides sont identifiés à partir des spectres MS/MS et les abondances relatives des peptides légers et lourds sont déterminées à partir des spectres MS. Cette technique permet de simplifier les échantillons complexes en ne marquant et sélectionnant

53 que les peptides ayant au moins une cystéine, d’autre part cela est considéré comme une limitation puisque les résidus cystéine sont rares ; il faut de plus disposer d’un peptide protéotypique contenant la cystéine et détectable en LC-ESI. De plus, la méthode n’est pas applicable au dosage de MPT quand la MPT est présente sur un peptide qui ne contient pas de cystéine (Patton et al., 2002).

Figure (8) ICAT tag d’après (Peng and Gygi, 2001)

Les deux formes légère et lourde du tag se différencient entre elles par 8 Da issus de huit 1_{H ou} 2_{H. les} 2_{H ont été remplacés par des} 13_{C ou} 15_{N afin d’éviter la différence de temps de rétention en} chromatographie (Zhang and Regnier, 2002).

ICPL (isotope-coded protein label): C’est un développement plus récent de la méthode ICAT

basé sur un marquage isotopique de tous les groupes amino libres des protéines (lysine et N- terminal non bloqué) (Schmidt et al., 2005) (Figure 9). Les protéines sont réduites, alkylées et puis marquées. L’ICPL a dépassé certaines limitations de l’ICAT puisque les groupes amines libres sont nombreux et donc plusieurs peptides marqués sont disponibles pour quantifier une protéine. De plus, l’ICPL permet d’analyser plus de MPTs par rapport à l’ICAT. La différence entre le peptide marqué et non marqué varie selon la séquence ce qui rend l’interprétation automatique compliquée.

Figure (9) ICPL tag d’après (Schmidt et al., 2005)

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iTRAQ (Isobaric tag for relative and absolute quantitation) : Dans cette approche, il n’y a

pas de différence de masse entre les peptides marqués. Par contre, les ions rapporteurs générés par la fragmentation des peptides marqués ont des masses différentes qui permettent la quantification relative entre les échantillons (Figure 10.C).Chaque réactif est composé d’un groupe rapporteur chargé qui est unique à chacun des quatre réactifs, un groupe peptidique réactif (amine spécifique), et un groupe d’équilibrage pour maintenir une masse totale de 145 Da (Figure 10.A-B). Cette technique est onéreuse à grande échelle. De plus, elle n’est pas compatible avec l’utilisation de gel comme une étape d’enrichissement car le groupe réactif des peptides (PRG) réagit avec les groupes aminés des réactifs du gel (e.g. acrylamide, tampon Tris et bicarbonate d’ammonium).

Figure (10) Méthodologie iTRAQ d’après (Ross, 2004)

Le réactif iTRAQ se compose d'un groupe rapporteur (sur la base de la N-méthylpipérazine), un groupe d'équilibrage de masse (carbonyle), et un groupe réactif avec le peptide (NHS-ester) (Figure 10.A). La masse globale du tag isobarique est maintenue constante à l'aide d'enrichissement isotopique différentielle avec des atomes 13_C, 15_N, 18_O.

55 Les masses des groupes rapporteurs varient de 114,1 à 117,1 Da tandis que les masses des groupes d'équilibre varient de 28 à 31 Da afin de maintenir les masses des différents tags à 145,1 Da (Figure 10.B). Lorsqu'il réagit avec un peptide, le tag forme une liaison amide avec un groupe aminé (N-terminal ou la fonction amine de la chaine latérale de la lysine), Les nombres entre parenthèses indiquent le nombre de centres enrichi dans chaque section de la molécule. Les quatre différents échantillons qui ont le même peptide, sont réduits, alkylés et digérés par la trypsine puis sont marqués chacun avec l’un des réactifs. Le complexe réactif-peptide a le même rapport m/z en mode MS tandis qu’en mode MS/MS, il se fragmente en donnant des ions rapporteurs différents (Figure 10.C) (Ross, 2004).

Le marquage par le diméthyle: C’est une autre méthode de marquage chimique de tous les

groupes amine libres des protéines où les peptides issus de la digestion de différents échantillons sont marqués avec différents tags de diméthyle marqués par des isotopes stables (Boersema et al., 2009). Les échantillons marqués sont mélangés et analysés simultanément par LC-MS durant laquelle la différence de masse des marqueurs de diméthyle est utilisée pour comparer l’abondance des peptides dans les différents échantillons. Cette méthode est rapide et moins chère par rapport à l’iTRAQ.

TMT (tandem mass tags): C’est une autre méthode de marquage chimique isobarique par

des tags de Guanidino-NHS Ester (Thompson et al., 2003). Comme dans le cas d’iTRAQ, le marquage est sur le N-terminal ou le groupe amine de la lysine. Le peptide, modifié par différents marqueurs, a la même masse. Les fragments TMT, en mode MS/MS, sont utilisés pour différencier le peptide dans les différents échantillons.

MeCAT (Metal-Coded affinity Tagging) : C’est une autre méthode de marquage chimique

des peptides et des protéines par des métaux rares (lanthanide) en utilisant la spectrométrie de masse par torche à plasma (ICP-MS). Ce type de source permet le dosage sensible et sélectif des hétéroatomes (tous les éléments sauf C, H, N et O) présents naturellement dans les protéines (S, P, Se et métaux) ou les lanthanides introduits par le marquage. La méthode MeCAT a été appliquée pour la quantification absolue des protéines en top-down et bottom- up (Bergmann et al., 2012).

La technique ICP-MS a aussi été appliquée sur des acides aminés purs, des peptides et des protéine en utilisant un marquage à l’iode pour la tyrosine (Pereira Navaza et al., 2009) ou sans marquage en quantifiant le soufre S des méthionines et cystéines ou le phosphore pour la phosphorylation (Fernández et al., 2012). Cette technique permet de réaliser une quantification absolue et sensible.

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Le marquage chimique par un tag d’isotope stable sur une phase solide: Le tag se

compose d’un linker photo clivable, une leucine qui contiens soit sept H (d0) soit sept deutériums (d7) et un groupe réactif avec le thiol de la cystéine (Zhou et al., 2002) (figure 11).

Figure (11) Le tag d’isotope stable sur une phase solide d’après (Zhou et al., 2002).

Après avoir été digérés, les peptides sont marqués avec un tag léger ou lourd ensuite les deux échantillons sont mélangés, les linkers sont clivés par l’UV et enfin les peptides sont analysés par µLC-MS/MS afin de déterminer la séquence et la quantité relative de chaque peptide. Cette méthode a été comparée avec l’ICAT pour détecter le changement du protéome induit par le galactose dans la levure Saccharomyces cerevisiae. (Zhou et al., 2002) Elle est relativement plus simple (automatisation), plus efficace (reproductibilité) et plus sensible.

Les différentes méthodes utilisant le marquage chimique permettent de réaliser une quantification relative (en général) avec des étapes de préparation et d’interprétations dans certains cas compliquées. Ces approches ne permettent pas dans la plupart des cas une quantification absolue.