Dilution par des isotopes stables

Quand la protéine d’intérêt est connue (quantification ciblée), cette méthode est la méthode de choix puisqu’elle détermine la quantité absolue de la protéine dans l’échantillon. La méthode AQUA (Absolute quantification) utilise un peptide de référence marqué par un isotope stable 13_{C et} 15_{N, conduisant à une différence de masse avec le peptide endogène. Ce peptide} marqué a la même séquence en acides aminés que le peptide endogène et élue au même temps de rétention. Les peptides marqués sont ajoutés après la digestion et le ratio entre les peptides non marqué et marqué est utilisé afin de quantifier la protéine.

Quand une méthode AQUA est développée, il faut respecter 3 étapes clés : le choix des peptides de références, l’optimisation de l’analyse en MS et l’étape de la digestion.

Le choix du peptide de référence est une étape cruciale. Le peptide de référence doit avoir une séquence spécifique dite « protéotypique » pour la protéine à quantifier et respecter certains critères résumés dans le tableau (2). Plusieurs stratégies ont été appliquées pour sélectionner les peptides protéotypiques (PPs) qui seront discutées dans le chapitre résultat. Tableau (2) Les critères de sélection les peptides protéotypiques pour la méthode AQUA d’après (Kamiie et al., 2008)

Critères de sélection

Détection par spectrométrie de masse Longueur comprise entre 6 et 16 acides aminés Pas de modification post-traductionnelle (MPT)

Pas de polymorphisme nucléotidique (SNP) Digestion par la trypsine Pas de région transmembranaire

Aucune coupure partielle (missed cleavage) Stabilité du peptide Aucun résidu méthionine ou cystéine Critères de seconde sélection Longueur comprise entre 8 et 10 acides aminés

59 Langenfeld et al. ont ajouté des critères au niveau de la séquence : Les résidus proline multipliés ont été considérés comme défavorables pour la synthèse; Asp-Gly (DG) et Asn-Gly (NG) sont à éviter à cause de leur sensibilité à l’auto dégradation (Langenfeld et al., 2009). Seibert et al. ont ajouté que les résidus réactifs (C,M et W) et les séquences non stables (NG, Q ou N à N-terminal) sont aussi à éviter (Seibert et al., 2009).

Malgré ces critères de sélection, certains peptides synthétisés n’ont pas l’intensité de signal suffisante ou ne sont pas détectés par la spectrométrie de masse (problème de digestion, faible ionisation ou adsorption sur les matériels). Les peptides marqués par un isotope stable sont disponibles commercialement (délai de 2 mois) mais ils sont onéreux (environ 800 euros par peptide). Il est aussi possible d’incorporer une modification post traductionnelle (MPT). Chaque peptide marqué est utilisé pour quantifier un seul peptide de la protéine, donc il est exigé d’utiliser plusieurs peptides répartis sur l’ensemble de la séquence de la protéine afin d’avoir une quantification fidèle et cela augmente le coût. Les peptides AQUA, chimiquement synthétisés, peuvent avoir des problèmes de solubilisation, adsorption et conservation (séquence dépendant). Ils sont ajoutés à la dernière étape car ils sont incompatibles avec les étapes de purification. Enfin, la méthode AQUA nécessite une digestion complète pour garantir une quantification fidèle.

Afin de résoudre les problèmes rencontrés avec les peptides AQUA, plusieurs techniques ont été proposées pour avoir des peptides protéotypiques adaptés à la quantification absolue. En 2005, Beynan et al. ont généré une protéine de synthèse (QconCAT) (quantification concatamer) qui est un ensemble des peptides tryptiques pour plusieurs protéines (Beynon et

al., 2005; Pratt et al., 2006). Un plasmide contenant un gène artificiel codant pour les peptides

protéotypiques des protéines d’intérêts est surexprimé dans E.Coli en milieu enrichi en 15_{N ou} en présence d’acides aminés marqués [13_C

6, 15N2] L-lysine and [13C6, 15N4] L-arginine (Brun et

al., 2007). La protéine QconCAT est ensuite purifiée, sa concentration déterminée et enfin

ajoutée avant l’étape de digestion trypsique pour produire les peptides marqués comme la méthode AQUA.

L’avantage de cette approche est dès que le gène est cloné, la protéine peut être produite, marquée et quantifiée à la demande. La protéine QconCAT est ajoutée avant la digestion permettant d’avoir plusieurs peptides marqués pour une protéine cible. Cette approche n’est pas adaptée à l’analyse des MPTs et elle nécessite une digestion complète. Une sensibilité différente aux protéases est remarquée entre la protéine QconCAT et la protéine cible (Rivers

et al., 2007).

Brun et al. ont développé en 2007 la stratégie appelée PSAQ (Protein Standard Absolute Quantification) basée sur l’utilisation d’une protéine recombinante marquée identique à la

60 protéine d’intérêt comme étalon interne (Brun et al., 2007), l'ensemble de la protéine est exprimée dans un organisme hôte qui est cultivé sous les mêmes conditions que pour la production de QconCAT. Cet étalon interne ajouté en quantité connue dès la première étape de préparation représente un étalon idéal qui permet d’éviter tous les problèmes rencontrés en cas de l’utilisation des méthodes AQUA et QconCAT pendant les différentes étapes de préparation (purification, digestion) (Figure 13). De plus, tous les peptides protéotypiques d’une protéine sont marqués ce qui améliore la couverture de la séquence et la fidélité de la quantification.

Par contre, cette approche n’est pas adaptée à l’analyse des MPTs. Pour chaque protéine à quantifier, une protéine standard est nécessaire : coût élevé et difficulté de produire la protéine (laborieuse). L’expression hétérologue de certaines protéines est encore difficile (e.g. CYP3A43) (Daly, 2006).

Figure (13) Les stratégies de la quantification absolue des protéines en utilisant la dilution d’isotope :

- PSAQ (protéine marquée) est ajouté tôt à la première étape de préparation de l’échantillon - QconCAT (protéine de synthèse contient des peptides marqués pour différentes protéines

cibles) est ajouté juste avant la digestion

- AQUA (peptide marqué) est ajouté après la digestion