major LV39 et major Friedlin.

A) Compte à l’hématimètre du nombre de cellules ayant migré dans la poche d’air après 6h.

B) Mesure par Western Blot de la Gal-3 libérée et non clivée (anticorps Mac-2) dans la poche d’air après 3h.

Afin de tenter de trouver la provenance de cette Gal-3 sécrétée, des macrophages (provenant de la différenciation de monocytes de moelle osseuse) et des fibroblastes (issues de la poche d’air) ont été mis en culture et stimulés par l’addition de parasite. Les résultats n’ont cependant pas été concluants, car aucune différence de sécrétion de Gal-3 n’a été observée par la stimulation de ces deux types cellulaires (Figure 22).

Figure 22: Mesure, par Western blot, de la libération de Gal-3 de taille complète (anticorps Mac-2) par les macrophages (A) et les fibroblastes (B) suite à une stimulation in vitro de 3h par le parasite Leishmania.

Clivage de la Gal-3 par les souches LV39 et Friedlin du parasite Leishmania

major

Afin de déterminer la capacité de L. major Friedlin et de L. major LV39 à cliver la Gal-3, des essais in vitro ont été effectués. Un premier essai a été effectué dans des conditions d’incubation sans sérum ou en ajoutant 10% de FBS (Figure 23).

Figure 23: Mesure, par Western blot, du clivage de la Gal-3 par L. major Friedlin et L. major LV39 dans des conditions d'incubation avec ou sans sérum (détection de la forme non clivée de la Gal-3 avec l’anticorps Mac-2).

Il est possible de tirer deux conclusions principales suite à cette expérience. La première est que L. major LV39 était plus efficace que L. major Friedlin pour cliver la Gal-3. La seconde est que le FBS semblait ralentir la cinétique de clivage de la Gal-3 par L. major LV39. En effet, en l’absence de FBS, la presque totalité de la Gal-3 était clivée dès la première heure d’incubation tandis que, lorsque 10% de FBS est ajouté au mélange réactionnel, un clivage équivalent n’était observé qu’après une incubation de 4h. Comme le

T G3 Friedlin G3 Friedlin LV39 Sans FBS 10% FBS LV39 1h 2h 4h

démontre la Figure 24, la Gal-3 était bel et bien clivée en des fragments de plus faible poids moléculaire. Il est aussi à noter que le FBS ne semble pas contenir de Gal-3; du moins, s’il en contient, les anticorps que nous utilisons ne sont pas capables de la détecter (Figure 25).

Figure 24: Détection, par Western blot, du clivage de la Gal-3 par L. major Friedlin et L. major LV39 dans des conditions d'incubation avec ou sans sérum (détection du CRD de la Gal-3 avec l'anticorps anti-CRD).

Figure 25: Contrôles utilisés pour les expériences de clivage de la Gal-3.

A) Détection de la forme entière de la Gal-3 avec l’anticorps Mac-2. B) Détection du CRD de la Gal-3 avec l’anticorps anti-CRD.

Afin de se rapprocher encore plus des conditions retrouvées in vivo, d’autres essais de clivage ont été effectués in vitro, en utilisant des lavages de poches d’air murines comme milieu d’incubation (Figures 26-27). Les lavages PBS représentent un milieu non inflammé tandis que les lavages suite à une injection de LPS représentent un milieu inflammé pouvant se rapprocher de celui obtenu lors de l’injection de L. major LV39 dans la poche d’air. Il est donc possible d’observer que L. major LV39 pouvait cliver la Gal-3 dans ce type de milieu d’incubation, mais que, similaire à ce qui a été observé par l’ajout de FBS, le fait de procéder à l’expérience dans les lavages des poches d’air ayant été stimulées avec du LPS semblait ralentir la cinétique de clivage de la Gal-3. En effet, après une heure d’incubation, il restait une plus grande quantité de Gal-3 non clivée dans le milieu d’incubation provenant des poches d’air stimulées au LPS que dans les poches d’air non stimulées (PBS). Il est cependant à noter que l’effet inhibiteur observé pour les lavages LPS (la totalité de la Gal-3 était clivée après 2h d’incubation) était inférieur à l’effet inhibiteur de l’ajout de 10% sérum au milieu d’incubation (il restait encore une quantité significative de Gal-3 après 2h d’incubation). La Figure 27 démontre bien le clivage de la Gal-3 par les bandes de plus faible poids moléculaire visibles en employant l’anticorps anti-CRD.

Figure 26: Détection, par Western blot, du clivage de la Gal-3 par L. major LV39 dans un milieu d'incubation constitué de lavages de poches d’air murines (détection de la forme entière de la Gal-3 avec l'anticorps Mac-2).

Figure 27: Détection, par Western blot, du clivage de la Gal-3 par L. major LV39 dans un milieu d'incubation constitué de lavage de poches d’air murines (détection du CRD de la Gal-3 avec l'anticorps anti-CRD).

Implication de la Gal-7 et de la Gal-9 dans la réponse immunitaire contre le parasite Leishmania : Expérience de la poche d’air

Figure 28: Comptes à l'hémacimètre des leucocytes ayant migré dans la poche d'air suite à une stimulation de 6h.

Afin de tester l’effet des Gal-7 et Gal-9 lors d’une infection avec le parasite Leishmania

major, des souris KO pour ces galectines ont été utilisées. Après une stimulation d’une

durée de 6h, les poches ont été lavées et les cellules recueillies ont été dénombrées (Figure 28).

Comparaison des différentes stimulations sur une même lignée de souris

Il a précédemment été discuté des résultats obtenus pour les souris WT (pages 47-48), je ne reviendrai donc pas sur ceux-ci dans cette section. Pour ce qui est des souris Gal-7 KO, bien qu’il semble à première vue avoir une différence entre le groupe injecté avec du PBS

et les deux groupes injectés avec des parasites, cette différence ne s’était pas montrée significative (PBS vs LV39, p = 0.207 et PBS vs Friedlin, p = 0.116). Les résultats obtenus pour les souris Gal-9 KO n’étaient pas non plus significativement différents entre eux (PBS vs LV39, p = 0.884 et PBS vs Friedlin, p = 0.263).

Comparaison des différentes lignées de souris pour une même stimulation

Les souris Gal-7 KO ont réagi différemment à la stimulation avec le parasite L. major Friedlin (Figure 29). En effet, alors que L. major Friedlin n’a induit qu’un recrutement cellulaire très faible (5.4x105 cellules/ml équivalent au 5.0 x105 cellules/ml du groupe PBS) chez les souris WT, le recrutement induit chez les souris Gal-7 KO était significativement supérieur (1.6 x106 cellules/ml, p = 0.029). Il est à noter que les recrutements cellulaires induits par la stimulation PBS (p = 0.360) et par la stimulation LV39 (p = 0.875) étaient équivalents pour les souris WT et Gal-7 KO.

Figure 29: Implication de la Gal-7 dans la migration des leucocytes dans la poche d'air après une stimulation de 6h.

Les souris Gal-9 KO (Figure 30) ont eu une réaction assez similaire aux souris Gal-7 KO. C’est aussi pour la stimulation faite avec le parasite L. major Friedlin qu’une différence significative fut observée entre les souris WT et les souris Gal-9 KO. Le recrutement cellulaire était plus important (p = 0.020) chez les souris Gal-9 KO (1.9 x106 cellules/ml) comparé aux souris WT (5.4 x105 cellules/ml). Il est aussi à noter que la différence de recrutement cellulaire visible entre les souris WT et Gal-9 KO pour les groupes PBS (p = 0.055) et LV39 (p = 0.431) n’était pas significative.

Figure 30: Implication de la Gal-9 dans la migration des leucocytes dans la poche d'air après une stimulation de 6h.

Implication de la Gal-7 et de la Gal-9 dans la réponse immunitaire contre le parasite Leishmania : Expérience d’infection du coussinet plantaire

L’expérience d’infection du coussinet plantaire nous a permis de suivre la progression de la maladie à travers les différentes étapes de celle-ci. Encore ici, l’emploi des souris Gal-7 KO et Gal-9 KO nous a permis d’évaluer l’effet de la perte de ces galectines sur le

développement à plus long terme de la maladie. Les mesures présentées dans ces graphiques représentent la différence de volume entre la patte infectée et celle qui ne l’est pas (les mesures ont été faites en millimètres).

À la fois pour les souris Gal-7 KO et Gal-9 KO et pour les parasites L. major Friedlin et L.

major LV39, aucune différence significative entre les lignées de souris KO n’a pu être

observée dans la première moitié de l’expérience qui représente la phase de croissance de la lésion (semaines 1 à 4).

Souris Gal-7 KO

Les souris Gal-7 ont démontré une tendance à avoir une phase de guérison plus rapide lors de l’infection avec le parasite L. major Friedlin. Cette tendance fut cependant mesurée de manière significative uniquement à la semaine 9 où le volume moyen du coussinet plantaire des souris WT était de 119.3mm3 comparé à 56.2mm3 pour les souris WT (p = 0.034). Du à la grande variation des mesures prises chez les souris Gal-7 KO pour les semaines 7 et aucune autre différence significative n’a été mesurée pour cette expérience. Aucune différence significative n’a non plus été obtenue par l’infection employant L.

major LV39 (Figure 31).

Figure 31: Implication de la Gal-7 lors du suivi de la réponse inflammatoire locale des souris infectées dans le coussinet plantaire avec L. major Friedlin ou L. major LV39 (suivi hebdomadaire de la différence de volume entre la patte infectée et la patte non-infectée, en mm3_).

Souris Gal-9 KO

Globalement, les souris Gal-9 KO ont réagi de manière similaire aux souris WT. Pour l’infection utilisant le parasite L. major Friedlin, aucune différence significative n’a été mesurée entre les souris Gal-9 KO et les souris WT au cours des 12 semaines d’expérience. L’emploi du parasite L. major LV39 a cependant révélé des différences significatives pour les semaines 7 (p= 0.035) et 9 (p = 0.043) où les pattes des souris WT étaient plus inflammées que celles des souris Gal-9 KO. Chez les souris WT, les différences de volumes entre les pattes infectées et non-infectées étaient de 98.3mm3 et de 90.7mm3 pour les semaines 7 et 9, respectivement. Les pattes des souris Gal-9 KO avaient quant à elles des différences de volume de 56.6mm3 et de 48.5mm3 pour ces deux mêmes semaines (Figure 32).

Figure 32: Implication de la Gal-9 lors du suivi de la réponse inflammatoire locale des souris infectées dans le coussinet plantaire avec L. major Friedlin et L. major LV39 (suivi hebdomadaire de la différence de volume entre la patte infectée et la patte non-infectée, en mm3_).

Discussion

Implication de la Gal-3 dans le recrutement de neutrophiles lors d’infections avec le parasite L. major LV39.

Les conclusions obtenues à propos de la Gal-3 lors de cette étude impliquant le parasite L.

major LV39 s’apparentent à celles précédemment obtenues au laboratoire lors de l’étude de

la pneumonie causée par Streptococcus pneumoniae. Les résultats obtenus pour le modèle de poche d’air ont démontré un déficit de recrutement de neutrophiles dans les souris Gal-3 KO lors d’une stimulation avec L. major LV39. Ce déficit du recrutement cellulaire a été dépendant du stimulant utilisé, car l’injection de LPS dans la poche d’air a occasionné un recrutement cellulaire similaire dans les souris WT et Gal-3 KO. Un résultat semblable avait en effet été obtenu avec le modèle de pneumonie où le recrutement de neutrophiles dans les poumons était grandement diminué chez les souris Gal-3 KO lors d’une infection avec S. pneumoniae. Le recrutement de neutrophiles était cependant similaire pour les souris Gal-3 KO et WT lors d’une infection avec. E. coli (Nieminen et al. 2008). Il est aussi à noter que seule la souche LV39 de L. major a été en mesure d’induite un recrutement de cellulaire lors de l’expérience de la poche d’air. L’injection du parasite L. major Friedlin a induit un faible recrutement cellulaire qui est semblable à celui qui a été induit par l’injection de PBS ; correspondant donc à un niveau de base. Bien que les deux souches de parasite induisent des manifestations cliniques similaires (ces parasites causant la forme cutanée de la leishmaniose), il a bien semblé y avoir une différence entre la réponse immunitaire innée engendrée par ces deux souches de parasites. Comme cette différence réactionnelle de l’hôte est survenue assez rapidement (dans les premières heures suivant l’infection), il est possible de croire que des variations au niveau des molécules présentes à la surface de ces deux souches de parasite puissent expliquer cette différence. Il a récemment été publié que le LPG présent à la surface des souches LV39 et Friedlin de L.

major est différent (Dobson et al. 2010). D’un point de vue général, les chaines latérales du

LPG de L. major (toutes les souches) possèdent des répétitions de Galβ1-3 alors que celles de L. donovani n’en possèdent pas. Il y a cependant une différence au niveau du nombre de répétitions de Galβ1-3 présentes sur les chaines latérales du LPG de L. major LV39 lorsque

comparé au nombre présent sur le LPG de L. major Friedlin (Figure 33). En effet, plus de 75% du LPG de L. major Friedlin possède aucune ou une seule répétition de Galβ1-3 sur les chaines latérales de son LPG. Celui de L. major LV39, possède par contre un nombre de répétitions beaucoup plus élevé; où plus de 75% des chaines latérales possèdent au moins 2 répétitions de Galβ1-3.

Figure 33: Illustration du pourcentage de LPG comportant le nombre de répétitions de Galβ1-3 spécifié sus ses chaines latérales.

En possédant un plus grand nombre de répétitions de Galβ1-3, le LPG de L. major LV39 offre un ligand de plus grande avidité à la Gal-3 (Pelletier et al. 2003). Celle-ci à donc la possibilité s’oligomériser et de former un plus grand nombre de liens avec le LPG de L.

major LV39 qu’avec le LPG de L. major Friedlin. En théorie, cela lui permet de pouvoir

exercer ses effets physiologiques de manière plus efficace. Finalement, le fait que la Gal-3 soit en mesure de lier les parasites L. major pourrait lui attribuer le qualificatif de récepteur des PAMPs. Les conséquences physiologiques de cette reconnaissance n’ont pour le moment pas encore été mises en évidence. En lien avec ce dernier point, des essais réalisés dans notre laboratoire n’ont pas été en mesure de mettre en évidence de défaut dans la capacité des macrophages et neutrophiles Gal-3 KO à phagocyter les parasites.

Libération de Gal-3 dans la poche d’air lors de stimulations avec L. major LV39

Le recrutement de neutrophiles qui a été mesuré à 6h post stimulation dans la poche d’air stimulée avec le parasite L. major LV39 corrèle bien avec la détection de Gal-3 libérée dans la poche d’air à 3h post stimulation. En effet, la mesure de la Gal-3 de taille complète dans les lavages de poche d’air a indiqué qu’il y a une augmentation d’environ 50% de la Gal-3 sécrétée détectée dans les poches d’air stimulées avec L. major LV39, lorsque comparé avec les poches d’air stimulées avec L. major Friedlin ou avec le PBS. Encore ici, ces résultats s’apparentent à ceux précédemment obtenus au laboratoire dans le modèle de pneumonie à pneumocoque où le niveau de Gal-3 retrouvée dans les lavages broncho- alvéolaires des souris infectées avec S. pneumoniae étaient supérieurs aux niveaux retrouvés chez les souris infectées avec E. coli ou traités au PBS (S. Sato et al. 2002). Comme il a précédemment été démontré que la Gal-3 pouvait lier à la fois les cellules endothéliales et les neutrophiles afin de faciliter la migration de ces derniers (Nieminen et al. 2007), il est possible de penser que la Gal-3 relâchée pourrait avoir le même effet dans le cas d’infection avec le parasite L. major LV39. Le fait d’avoir une quantité plus importante de Gal-3 de libérée dans le milieu extracellulaire pourrait donc expliquer le nombre plus élevé de neutrophiles retrouvés dans les poches d’air stimulées avec L. major LV39. Il est aussi possible d’élargir ces résultats à l’expérience d’infection du coussinet plantaire effectuée chez les souris Gal-3 KO et WT. Lors de cette expérience, les niveaux d’inflammation des coussinets plantaires des souris Gal-3 KO étaient supérieurs aux niveaux mesurés chez les souris WT suite à l’infection avec le parasite L. major LV39. Les niveaux de neutrophiles ayant migré à la fois vers le coussinet plantaire et vers les nœuds lymphatiques drainant cette région étaient aussi inférieurs chez les souris Gal-3 KO ; laissant penser que, tout comme dans la poche d’air et dans le modèle de pneumonie, la Gal-3 a un rôle à jouer dans le recrutement de neutrophiles au coussinet plantaire des souris infectées avec L. major LV39. Dans le cas des souris Gal-3 KO, l’absence de Gal-3 engendre un niveau d’inflammation supérieur qui corrèle avec un nombre de neutrophiles inférieur ainsi qu’avec une charge parasitaire supérieure dans ces souris. Cette expérience montre du même coup l’implication des neutrophiles dans l’éradication des parasites. Les

niveaux de Gal-3 extracellulaires n’ont cependant pas été mesurés dans les coussinets plantaires ou dans les nœuds lymphatiques des souris WT infectés ou non infectés (pour voir si, comme dans le cas de la pneumonie à S. pneumoniae, l’infection avec L. major provoque une libération de Gal-3 similaire à ce qui a été observé dans l’expérience de la poche d’air). Cette mesure serait cependant difficilement réalisable. Il ne serait pas pertinent de procéder par une homogénéisation des tissus, car cela occasionnerait un bris cellulaire; entrainant ainsi la libération de la Gal-3 initialement contenue à l’intérieur des cellules. Cela fausserait nos données, car nous ne voulons mesurer que la Gal-3 extracellulaire ; soit celle qui peut potentiellement jouer un rôle dans la réponse immunitaire. Des études histologiques pourraient cependant être effectuées. Il serait alors possible d’effectuer un marquage de la Gal-3 et il suffirait alors d’identifier et de compiler uniquement la Gal-3 se retrouvant dans le milieu extracellulaire. Reste cependant à voir la faisabilité de cette technique de marquage.

Il est aussi à noter que la présence de Gal-3 extracellulaire est à elle seule suffisante pour induire un recrutement de neutrophiles. Des expériences menées au sein de notre laboratoire ont en effet démontré un pouvoir pro-inflammatoire à la Gal-3 qui pourrait alors être considérée comme un DMAP (Milot et al., en préparation). Bien que la Gal-3 ne soit pas chimioattractante in vitro (Nieminen et al. 2008), son injection dans la poche d’air des souris est suffisante pour induire un recrutement de neutrophiles significatif à 6h post stimulation. Ce pouvoir pro-inflammatoire semble provenir de la capacité de la Gal-3 à induire la sécrétion de certaines cytokines et chimiokines.

Afin de tenter de déterminer la provenance de cette Gal-3 libérée dans la poche d’air lors de la stimulation avec L. major LV39, des macrophages obtenus suite à la différenciation des monocytes de la moelle osseuse ainsi que des fibroblastes obtenus par extraction des cellules tapissant l’intérieur de la poche d’air des souris ont été mis en culture et stimulés par l’ajout de parasites. Les résultats obtenus n’ont cependant pas démontré de différences notables entre l’ensemble des stimulations effectuées (PBS, L. major Friedlin, L. major LV39). Deux théories peuvent être apportées pour expliquer ces résultats non représentatifs de ce qui a été obtenu in vivo. Il est premièrement possible que nous n’ayons pas testé les cellules qui sont véritablement responsables des différences de libération de Gal-3 dans la

poche d’air. La Gal-3 a en effet aussi été identifiée comme étant produite chez d’autres cellules de la peau, comme les kératinocytes (Konstantinov et al. 1994) et les cellules de Langerhans (Wollenberg & Salle 1993). Il est aussi possible que les conditions reproduites

in vitro ne soient pas adéquates pour observer les mêmes différences obtenues in vivo. Les

cellules utilisées in vitro ne possèdent pas non plus les mêmes caractéristiques que celles retrouvées in vivo; entre autres par rapport à leur niveau d’activation et de maturation.

L. major LV39 et L. major Friedlin peuvent cliver la Gal-3, mais la cinétique

de clivage est ralentie dans des conditions se rapprochant de ce qui est rencontré in vivo.

Les études préalablement publiées par notre laboratoire ont démontré la capacité des neutrophiles (Nieminen et al. 2005) ainsi que des parasites Leishmania (Pelletier & S. Sato 2002) à cliver la Gal-3 et cela de manière assez rapide ; soit en une trentaine de minutes. Cela m’a donc porté à me questionner à savoir pourquoi des quantités significatives de Gal- 3 de taille complète étaient toujours détectables dans les lavages de poche d’air où sont présents des neutrophiles ainsi que des parasites. La première expérience effectuée afin de répondre à ce questionnement a été de procéder à des tests de clivage de la Gal-3 dans un milieu d’incubation contenant du FBS afin de se rapprocher quelque peu les conditions retrouvées in vivo dans la poche d’air ou dans le coussinet plantaire des souris (les