MacroH2A et ADP-ribosylation

Le domaine macro est retrouvé dans de nombreuses protéines et existe chez tous les

organismes. Il est constitué de 135 résidus principaux et peut être répété jusqu’à trois fois

dans une même protéine (Ladurner 2003). En 2003, des études structurales montrent une forte

similarité entre le domaine macro de la famille AF1521 et la superfamille des hydrolases

triphosphate. De plus, un membre de cette famille AF1521 est une ADP-ribose

phosphoestérase (Allen, Buckle et al. 2003). Ceci suggère un lien entre le domaine macro et la

régulation du métabolisme de l’ADP-ribose.

En 2005, les recherches se poursuivent et permettent de démontrer que le domaine macro de

AF1521 se lie avec une forte affinité à des ADP-riboses. Des mutagenèses dirigées révèlent

l’existence d’une « poche » dans le domaine macro. Cette cavité permettrait de lier un ligand

et de réaliser des contacts avec l’ADP-ribose (Karras, Kustatscher et al. 2005).

C’est au niveau de cette poche que réside des différences spécifiques entre les deux isoformes

de macroH2A1. Dans la forme 1.1, une phénylalanine induit une courbure, et deux glycines

(223 et 224) sont remplacées par des résidus plus volumineux dans la forme 1.2 (Lys226 and

Asp227). De plus, macroH2A1.2 présente une insertion de trois résidus (E-I-S). Ces faibles

divergences induisent une perte de reconnaissance du monomère d’ADP-ribose par le

domaine macro de macroH2A1.2 (Figure 22) (Kustatscher, Hothorn et al. 2005).

Un petit nombre de virus à ARN animaux codent pour des domaines macro. Leur analyse

structurale révèle que ces domaines lient efficacement l’ADP-ribose libre, ou lié à PARP-1

(Egloff, Malet et al. 2006).

Les protéines de la famille BAL (B-aggressive lymphoma) portent une combinaison inédite,

avec en N-terminal un domaine macro capable de réprimer la transcription, et en C-terminal

un domaine PARP actif (Aguiar, Takeyama et al. 2005).

b

Figure 22 : L’épissage alternatif du variant d’histone macroH2A1 régule

la fixation des métabolites NAD

a) Schéma représentant l’épissage alternatif de l’histone humaine macroH2A1 : en gris

sont indiqués les résidus inchangés, et en bleu les insertions présentes dans la forme

macroH2A1.2

b) Structure du domaine macro de macroH2A1.1, représenté en brun. En jaune est indiqué

l’exon épissé alternativement dans la forme macroH2A1.2. Les résidus critiques pour la

fixation de l’ADP-ribose sont mentionnés (d’après Kustatscher G, 2005).

Quelle est la signification fonctionnelle de cette interaction entre le domaine macro et

l’ADP-ribose ? Le variant d’histone macroH2A a-t-il un lien avec les protéines responsables de la

synthèse du poly(ADP-ribose), les PARPs ?

En utilisant une lignée stable de HeLa exprimant une macroH2A1.1 étiquetée (e-mH2A1),

nous avons montré récemment que les nucléosomes contenant e-mH2A1 sont spécifiquement

associés avec PARP-1, via la région non histone. Cette association conduit à l’immobilisation

de PARP-1, et à une inhibition de son activité enzymatique. Plusieurs promoteurs enrichis en

macroH2A1 ont été identifiés, notamment celui du gène de HSP70.1. Une élimination de

PARP-1 ou de macroH2A par siRNA ralentit la transcription du gène Hsp70.1.

L’interaction macroH2A-PARP serait cruciale pour maintenir l’inactivation de ce gène : en

s’associant avec le variant, PARP-1 prendrait place dans un complexe de répression

transcriptionnelle. Suite au choc thermique, un changement conformationnel de macroH2A

libérerait l’enzyme, ce qui la rendrait active (Ouararhni, Hadj-Slimane et al. 2006)/annexe 4.

Ces résultats ont été étoffés par une autre étude, montrant que macroH2A1.2 et PARP-1

peuvent également interagir. La région non histone de chacune des isoformes de macroH2A

est capable d’inhiber l’activité enzymatique de PARP-1 in vitro (Nusinow, Hernandez-Munoz

Les variants d’histone sont une nouvelle voie de modification épigénétique que la cellule

utilise pour moduler la structure chromatinienne et l’expression des gènes. MacroH2A est l'un

de ces variants et se singularise par sa grande taille. Contrairement à H2A.X et H2AZ, il

n’existe que peu de données génétiques ou biochimiques concernant macroH2A. Mon travail

de thèse s’est axé sur l’étude de ce variant.

Par immunofluorescence, macroH2A est retrouvé accumulé sur le territoire du chromosome X

inactif chez les mammifères femelles. Il pourrait jouer un rôle dans le maintien de son état

répressif. Néanmoins, cette hypothèse reste encore aujourd’hui controversée. La spécificité

même de l’association entre macroH2A et le Xi est remise en cause, étant donné la forte

concentration en nucléosomes de cette région.

Certaines expériences biochimiques ont permis cependant d’identifier quelques gènes du Xi

où macroH2A se localiserait de façon préférentielle. Cet enrichissement étant de faible

importance, la question de l’implication réelle de cette protéine dans le mécanisme

d’inactivation du chromosome X reste ouverte.

Existe t-il vraiment une surexpression de macroH2A au niveau du chromosome X inactif ? Ce

variant d’histone est-il impliqué fonctionnellement dans le maintien de la répression

transcriptionnelle du Xi ?

Pour répondre à ces questions, nous avons réalisé des immunoprécipitations de chromatine

combinées avec diverses hybridations sur puces à ADN («ChIP-on-CHIP»). Par cette

approche, l’enrichissement en macroH2A ne dépend pas du degré de condensation de la

chromatine. Nous avons également développé une approche d’ARN interférence, permettant

une élimination conséquente de macroH2A, qui nous a permis d’étudier l’impact du variant

sur la maintenance de l’état inactif du Xi.

La description de ces travaux constituera la première partie du chapitre « Résultats ».

De nombreuses données suggèrent que macroH2A pourrait participer à l’inactivation de la

transcription. Au cours de ma thèse, j’ai participé à plusieurs études qui ont permis de préciser

cet effet de répresseur transcriptionnel, in vitro, mais également in vivo. Cette partie de mon

travail a été présentée dans la section « Introduction » de ce manuscrit, et les trois

publications correspondantes figurent en annexe 1, 2 et 3.

Nous avons souhaité nous intéresser plus particulièrement au rôle potentiel de macroH2A

dans le mécanisme de réparation de l’ADN. En effet, il a été montré que le domaine macro

est capable de lier l’ADP-ribose, un nucléotide déterminant dans de nombreux processus

biologiques tels que la transcription ou la réparation de l’ADN. De plus, nous avons démontré

récemment une association entre macroH2A et PARP-1 in vitro, conduisant à une inhibition

de son activité enzymatique. Ces données ont été publiées dans Genes and Development et

sont présentées en annexe 4.

Plusieurs types d’expériences ont donc été conduites pour évaluer l’impact de macroH2A sur

la réparation des cassures simple brin de l’ADN assurée par PARP-1. L’ensemble des

résultats obtenus seront détaillés dans la seconde partie du chapitre « Résultats ».

MATERIEL ET METHODES

A. Biologie cellulaire

B. Techniques d’analyses in situ

C. Approches de « ChIP-on-CHIP »

D. Techniques d’analyses des protéines

E. Clonage

A. BIOLOGIE CELLULAIRE