Méthodologies utilisées pour l’évaluation de l’activité antimicrobienne :

Selon la souche microbienne, les composés testés et l’application choisie, divers milieux de culture peuvent être mis en œuvre. Les différents protocoles sont classés selon le milieu dans lequel se fait la diffusion du composé. Les différentes méthodes d’évaluation de l’activité antimicrobienne sont indirectement liées entre eux.

Dans ce qui suit, nous décrirons les techniques d’études in vitro que nous avons utilisées pour la détermination du pouvoir antibactérien/antifongique de quelques composés préparés.

Les espèces bactériennes à Gram négatif telle Escherichia coli (ATTC-25922),

Pseudomonas aeruginosa (ATCC-27853), et de Gram positif Staphylococcus aureus

(ATTC-25923) nous ont été fournies par le Laboratoire de Microbiologie du Centre Hospitalier Universitaire Dr Ben Badis de Constantine. La bactérie phytopatogéneà Gram positif Pseudomonas syringae (Ps: Kc 311253) et la lévure Pichia caribbica (Kc 977491) nous ont été fournies par le laboratoire de Mycologie, de Biotechnologie et de l’Activité Microbienne, de l’Université Mentouri-Constantine1. Ces espèces ont été conservéessur gélose nutritive. Chaque espèce a été activée sur milieu gélosé 24 heures avant la réalisation des tests antimicrobiens.

5.5.3.1 Préparation des suspensions de micro-organismes et ensemencement

Les suspensions bactériennes, préparées à partir de bouillons de d’enrichissement (TCBS) des différentes souches des espèces bactériennes, sont repiquées par la méthode des stries dans des boites de Pétri contenant le milieu Müeller-Hinton-Agar (MHA) pour les bactéries humaines pathogènes, et dans le YPGA (Yeast, Peptone-Glucose-Agar) et LPGA ( l’extrait de Levure-Peptone-Glucose-Agar) pour la levure et la bactérie phytopathogène respectivement , puis incubées à respectivement 37°C et 30°C pendant 24 h pour les souches bactériennes, et 48h pour la souche fongique. Une ou plusieurs colonies de chaque culture pure sont prélevées et transférées dans l’eau physiologique dont la turbidité est ajustée à 0,5 McFarland (densitimètre) qui correspond à une densité microbienne de l’ordre de 10⁶ cellules/mL. Un prélèvement à partir de cet inoculum (400 L) sert à ensemencer de nouvelles boites de Pétri (diamètre 9 cm) contenant 18 mL du milieu de culture par la technique d’écouvillonnage, ou par la technique d’inondation avec étalement.

82 Pour la tecnique d’écouvillonnage, un écouvillon stérile et sec, trempé dans la suspension bactérienne précédemment préparée, est essoré contre les parois de la boite de pétri. On ensemence la boite de pétri contenant le MHA à partir du point le plus éloigné du centre (au niveau de la bordure) en faisant déplacer l’écouvillon sur toute la surface de la boite, de la gauche vers la droite tout le long de la boite. On fait pivoter ensuite la boite de 60° et on répète la même opération encore 3 fois (Fig. 43). On laisse sécher les boites de Pétri pendant quelques minutes à la température ambiante (le couvercle doit être emboité). L`épaisseur de la gélose doit être strictement de 4 mm repartie uniformément sur toute la surface de la boite de Pétri

Figure 40 : Technique d’ensemencement des boites de Pétri

5.5.3.2 Méthode des disques :

Nous avons utilisé dans notre étude les disques de papier Wattman N° 3 de diamètre 6 mm, ces derniers doivent avoir un contour régulier pour donner une zone d`inhibition facile à mesurer. Les disques une fois stérilisés dans l’autoclave pendant 20 minutes à 120° C, sont chargés de 10μL de composés solubilisés dans le DMSO prélevé d’une solution contenant 20 mg/mL, ce qui donne une charge du disque de 100 µg, puissont placés à la surface de ces boites préalablement ensemencée avec la suspension bactérienne. Les disques de contrôle négatif sont imprégnés de DMSO. Des disques standards contenant l’antibiotique de référence (spiramycine100 μg) servent de contrôle positif. Les boites de pétri sont incubées à 37°C pour les souches bactériennes et à 30°C pour les souches fongiques, pendant 24h. Les diamètres des zones d’inhibition produites autour des disques sont mesurés et exprimés en mm.

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Figure 41 : Protocole de détermination de la zone d’inhibition en milieu solide (disques)

5.5.3.3 Méthode des puits :

Cette méthode est similaire à celle des disques sauf que le produit à tester n’est pas imprégné sur des disques, mais une solution de concentration connue est versée dans un puit de diamétre 6 mm crée dans la gélose préalablement ensemencée.

5.5.3.4 Détermination de la CMI :

Une étude de détermination de la concentration minimale inhibitrice (CMI ou MICs) permet de confirmer en général les résultats des tests de la diffusion sur disque. La CMI est définie comme la concentration minimale à laquelle aucune poussée bactérienne n’est observée. Cette méthode, complémentaire de la méthode de diffusion sur disque, est également considérée comme un indicateur fiable de la mesure de l'activité antibactérienne, et peut être utilisée en milieu solide ou liquide, mais la plus économique est celle en milieu solide. Cette technique est illustrée dans ce qui suit :

Du milieu de culture gélosé préalablement stérilisé à 120°C pendant 15 minutes à l’autoclave, on prelève 9 mL qu’on place dans un tube à hémolyse. On ajoute 1mL du composé à tester de concentration connue puison homogénise la solution au vortex (mixeur). La solution homogène est versée (coulée) dans une boite de pétri (on laisse refroidir lentement pour éviter la formation gouttelettes d'eau). On trompe le bout fermé d’une pipette stérile dans le tube à hémolyse contenant la suspension bactérienne, et on le fait glisser doucement sur la surface de la boite de pétri de façon à former une strie. Chaque boite de pétri contiendra ainsi autant de stries que de souches bactériennes (cinq stries pour les cinq souches). Pour confirmer la croissance des germes, et pour chacune des souches microbiennes étudiée, deux boites de Pétri témoins sont utilisées : l’une contenant le milieu de culture ensemencé avec la suspension microbienne (l’apparition de zone d’inhibition confirme l’activité des germes), et

84 la seconde composée de la gélose et du solvant utilisé (test de la neutralité du solvant). Les boites sont ensuite incubées pendant 24h à 37°C pour des souches bactériennes,et 30°C pour la levure.

Figure 42 : Protocole de la détermination de la CMI

L’opération est répétée pour chaque produit testé de concentration bien définie (solutions de concentrations croissantes) jusqu’à l’apparition d’une poussée bactérienne. On notera la valeur de la concentration précédent la poussée: c’est la concentration minimale inhibitrice (CMI). Les valeurs des concentrations minimales inhibitrices de chaque composé testé sont exprimées en μg/mL. Les composés testés ont été préparés à des concentrations différentes par dilution à l’éther, à partir d’une solution mère contenant 5 mg du composé à tester dans 1 mL du mélange éther/acétone 9/1)