Evaluation de l’hépatotoxicité de quelques dérivés hybrides 1- 1-méthylbenzimidazole-hétérocycle

O R² O R² NH₂ N ^N N ^N 46. R1= CH₃, R2= OEt; Rdt= 51% 47. R^1-2= CH₂C(CH₃)₂CH₂; Rdt= 30% 48. R¹= R²= CH₃; Rdt= 28 % AlCl₃ ClCH₂CH₂Cl reflux 31-33 46-48 Schéma 121

5.7.6 Evaluation de l’hépatotoxicité de quelques dérivés hybrides 1-méthylbenzimidazole-hétérocycle.

Dans une étude préliminaire de l’activité biologique, nous avons soumis les composés hybrides benzimidazole-4H-pyrane 31, 32 et 33 à une évaluation de leur hépatotoxicité. On

rappellera que l’hépatotoxicité d’un médicament est considérée comme un facteur très important et discriminatoire dans la mise sur le marché de ce dernier.²⁴⁴ Le criblage anti-hépatotoxicité dans le système in vitro (screening), est effectué sur des cellules HepG2 à différentes concentrations,²⁴⁵ en utilisant la méthode d’Ellman.²⁴⁶

244

O’Brien, P. J.; Irwin, W.; Díaz, D.; Howard-Cofield, E.;Krejsa, C. M.: Slaughter,R.; Gao, B.;Kaludercic, N.;Angeline, A.;Bernardi, P.; Brain, P.;Hougham, C. Arch Toxicol. 2006, 80, 580.

245

Schoonen, W. G. E. J.; Westerink, W. M. A.; de Roos, J. A. D. M.; Debiton, E. Toxicol.in Vitro, 2005, 19, 505.

246

163 Cette approche nous permettrait de procéder à une étude de la relation structure-activité (SAR), du fait que ces composés se différencient entre eux par la nature du groupement électroattracteur en position 3 (acétate, acétyle ou cétone cyclique) seulement.

Les composés sélectionnés sont représentés dans la figure qui suit :

O NC NH2 R² 31. R¹= OMe; R²= Me 32. R^1-2= CH₂-C(CH₃)₂-CH₂ 33. R¹= R²= Me O _R1 N N Me

Figure 59 : Dérivés benzimidazole-4H-pyranes soumis à l’évaluation de leur hépatotoxicité

La viabilité des cellules hépatiques de chaque composé testé à différentes concentrations est exprimée en pourcentage (% mole). La viabilité cellulaire a été mesurée en tant que réduction du MTT et les données ont été normalisées en tant que% de contrôle. Les données sont exprimées comme la moyenne ± s.e.m. de trois essais effectués sur au moins trois cultures cellulaires différentes à des concentrations croissantes (1-300 μM). Les comparaisons entre les médicaments et le groupe de contrôle ont été effectuées par une ANOVA suivie par le test post-hoc de Newman-Keuls. La Tacrine a été choisie comme médicament de référence standard.

Les résultats du screening anti-toxicité envers les cellules hépatiques HepG2 des composés sélectionnés sont rassemblés dans le tableau 20.

Tableau 20 : Criblage anti-hépatotoxicité des hybrides

1-méthylbenzimidazole-4H-pyrane

*** P <0,001, ** P <0,01, * P <0,05 et ns non significatif par rapport au groupe témoin.

% Viabilité des cellules HepG2

Composé 1 M 3 M 10 M 30 M 100 M 300 M

31 97.10.79^ns 91.20.4^* 84.92.50^*** 73.41.73^*** 71.71.81^*** 72.32.92^*** 32 98.90.22^ns 89.40.95^*** 85.11.00^*** 84.30.57^*** 82.61.79^*** 77.61.38^*** 33 97.31.58^ns 90.91.44^* 89.02.39^** 85.81.83^*** 72.20.58^*** 74.92.19^*** Tacrine 93.44.69^ns 902.95^ns 88.73.42^ns 81.64.88^* 64.34.54^*** 402.20^***

164 L’analyse des résultats de l’évaluation in vitro de l’hépatotoxicité en fonction de la concentration envers des cellules HepG2 montre que :

 L’hépatotoxicité augmente avec la concentration

 Les composés testés présentent dans la plupart des cas, une hépatotoxicité moindre que la Tacrine dans le gradient de concentrations (1 -300 M). Ils sont moins hépatotoxiques que la Tacrine à c = 1 M, et à c ≥ 100 M. On notera qu’à 3 M ≥ c ≥ 30 M, la viabilité des cellules hépatique est comparable, dans la plupart des cas, à celle deTacrine.

 A 1≤ c ≤ 100 M, les composés 31 et 33 montrent une viabilité cellulaire comparable.

 Le composé 32 qui présente une fusion de la cyclohéxanone avec le noyau 4H-pyrane est le moins cytotoxique à c = 100 et 300 M (viabilité des cellules HepG2 de 82.6 et 77.6%), et le composé 31 porteur de la fonction ester est le moins performant à c ≥ 10 M (% viabilité des cellules 84.9, 73.4, 71.7 et 72.3%).

La détermination du rapport entre la viabilité des cellules hépatiques des composés préparés avec la Tacrine à une concentration donnée, devrait nous donner une idée précise de l’effet hépatotoxique. Pour ce faire nous avons calculé le pourcentage maximal de cellules hépatiques détruites pour chaque composé à une concentration précise en introduisant l’erreur standard commise sur les trois mesures effectuées, puis en déterminant le facteur de multiplicité (tableau 21). Ce calcul a été établi comme suit :

% Maximal de cellules détruites (hépatotoxicité) = 100% - %(viabilité-erreur standard) Facteur de multiplicité = % Max (Tacrine) / % Max. produit

 Exemple : pour le composé 32 à c= 300 M

% Max. de cellules détruite = 100% - (77.6% – 1.3%) = 100% - 75.2% = 24.8% Facteur de multiplicité = 62.2 % .Max (Tacrine) / 24.8% Max. produit = 2.5

Donc le composé 32 est 2.5 fois moins hépatotoxique que la Tacrine àc= 300 M

Tableau 21 : % maximal de cellules hépatiques détruites et facteur de multiplicité. % Maximal de cellules HepG2 détruites (facteur de multiplicité)

Composé 1M 3 M 10 M 30 M 100 M 300 M

31 3.7 (3.02) 9.2 (1.40) 17.3 (0.85) 28.3 (0.81) 30.1 (1.33) 30.6 (2.0) 32 1.3 (8.61) 11.5 (1.12) 15.9 (0.92) 16.2 (1.43) 19.1 (2.10) 24.8 (2.5) 33 4.2 (2.66) 10.5 (1.22) 13.4 (1.09) 16 (1.45) 28.3 (1.42) 27.2 (2.28)

165 La détermination du taux de toxicité maximal des composés testés envers les cellules hépatiques HepG2 à différentes concentrations confirme ceux de l’hepatotoxicité et en particulier montre que :

 Hormis le composé 31 à c= 10 et 30 M et le composé 32 à c= 10M, les composés préparés sont moins cytotoxiques que la Tacrine aux différentes concentrations testées.

 A une concentration de 10 M, les composés 32et 33 ont une toxicité moindre ou légèrement supérieure (composé 31) à celle de la Tacrine, et ils sont de 2.0 à 2.5 fois moins hépatotoxique que la Tacrine à c=300 M.

 L’analyse des résultats de l’hépatotoxicité de la série montre que le composé 32 est le moins cytotoxique avec le facteur de multiplicité le plus haut, il est environ 9 fois moins toxique (8.61) que la Tacrine à une concentration de 1M. Le facteur de multiplicité passe à 2.1 à c= 100M, et à une concentration 300 fois plus grande que la concentration initiale, il est de 2.5 fois moins toxique que la Tacrine.

En résumé, nous affirmer que :

 La viabilité des cellules hépatiques HepG2 diminue quand la concentration augmente, en d’autres termes l’hépatotoxicité augmente avec la concentration.

 L’hépatotoxicité augmente moins vite que la concentration. En effet si on considère le substrat le moins performant, le composé 31 par exemple, une augmentation de la concentration d’un facteur de 10, 100 ou 300 par rapport à la concentration initiale de 1M, entraine une diminution de la viabilité des cellules d’un facteur de 1.06, 1.35 et 1.34 respectivement.

 Nous pouvons conclurequ’une corrélation peut être mise en évidence, et qu’il existe une relation structure-activité mettant en exergue la nature de la substitution du cycle 4H-pyraneet l’activité hépatotoxique. Le composé 32, qui présente une fusion d’un cycle à six chaînons porteur d’une fonction cétone avec le 2-amino-3-cyano-4-(1-méthylbenzimidazol-2-yl)-4H-pyrane est beaucoup moins cytotoxique que ses analogues porteurs de fonction carbonyle libre, et que pour les composés testés la viabilité des cellules hépatiques HepG2 est nettement supérieure à celle de la Tacrine.

166

6 Conclusion

Toute une variété de composés poly-hétérocycliques contenant comme structure de base le motif 1-méthylbenzo[d]imidazole a été préparée à partir du 1-méthyl-1H-benzo[d]imidazole-2-carbaldéhyde. Des hétérocycles de structures diversifiées et hautement fonctionnalisées tel que des 4H-pyranes, chromènes, benzochromènes, 1,4-dihydropyridines, quinazolines, pyridines et autre pyrrolidines ont été greffés en position 2 du noyau 1-méthyl-1H-benzo[d]imidazole en utilisant des méthodes adéquates et appropriées.

Dans une étude préliminaire de l’activité biologique, nous avons soumis quelques composés hybrides (1-méthyl-1H-benzo[d]imidazol-2-yl)-4H-pyrane (composés 31-33) à une évaluation in vitrode leur hépatotoxicité envers les cellules hépatiques HepG2.

De même la préparation d’analogues structuraux de la Tacrine (composés bioactif utilisé dans le traitement de la maladie d’Alzheimer) a été exploré et trois composés hybrides benzimidazole-tacrine ont été préparés.

167

7-Partie expérimentale

7.1 Préparation des matériaux de départ et autres intermédiaires-clé : 7.1.1 Préparation de 1-(1H-benzimidazol-2-yl) méthanol (27):

Mode opératoire : A 5.0 g d’o-phénylènediamine dissous dans 100 mL d’une solution

d’acide chlorhydrique (4N) sont ajoutés 3.0 éq. d’acide glycolique. Le mélange réactionnel est chauffé à 90°C pendant 24 heures. Le mélange réactionnel est refroidi puis alcalinisé par l’ajout, goutte à goutte, d’une solution d’ammoniaque 10% jusqu’à pH 9. Le solide formé est alors séparé par filtration, lavé à l’eau, puis séché à l’air libre.

Formule brute : C₈H₈N₂O

Masse molaire : 148.16 g/mole Aspect du produit : solide jaunatre Rendement : 88% T. fusion : 120°C N H N OH 27 IR (KBr) cm^-1: ν 3300-2500, 1620, 1442, 1269, 1211, 1045, 740. RMN ¹H (250 MHz, CDCl₃): δ 8.10-8.03 (m, 2H, H-Ar), 7.72-7.65 (m, 2H, H-Ar), 5.41 (s, 2H, CH₂).

7.1.2 Préparation du (1-méthyl-1H-benzo[d]imidazol-2-yl) méthanol (28):

Mode opératoire : 1.0 éq. du (1H-benzimidazol-2-yl) méthanol est ajouté à 1.2 éq. de

NaOH dissous dans un mélange H₂O/EtOH (10.5: 4.5 mL). A 0°C et sous agitation magnétique, on ajoute goutte à goutte, 5 mL de diméthyle sulfate, sur une durée de 30 à 40 min (lors de l’ajout, la température ne doit pas dépassée 5°C). Le mélange réactionnel est ensuite abandonné à 0°C pendant 30 min puis à la température ambiante pendant 15 min. Le solide blanc obtenu est séparé par filtration, lavé puis séché. Une quantité supplémentaire du même produit est extraite à partir du filtrat avec un volume adéquat du CH2Cl2. La phase organique est séparée, séchée sur Na2SO4 anhydre et le solvant évaporé à sec. Le résidu obtenu est ensuite recristallisé dans un mélange acétonitrile/EtOH.

168 Formule brute : C₉H₁₀N₂O

Masse molaire : 162.19 g/mole Aspect du produit : solide blanc Rendement : 72%

T. fusion : 122-124 °C (Lit.^ref = 125°C)

N N OH 28 IR (KBr) cm^-1: ν 3300-2500, 1681, 1470, 1338, 1218, 1029, 871, 744. RMN ¹H (250 MHz, CDCl₃): δ 7.76-7.64 (m, 1H, H-Ar), 7.29-7.19 (m, 3H, H-Ar), 5.13 (s_L, 1H, OH), 4.88 (, s, 2H, CH₂), 3.81 (s, 3H, N-CH₃).