Méthodes de préparation d’échantillons

Les analyses chromatographiques réalisées sur des matrices biologiques nécessitent une préparation d’échantillon visant à :

 éliminer, de façon la plus totale possible la matrice qui est à la source de coélutions en chromatographie, et de suppression ionique en spectrométrie de masse,

 préconcentrer les molécules recherchées afin d’obtenir une méthode sensible.

Dans le cas des urines, la matrice est essentiellement constituée de sels et de molécules très polaires telles que l’urée et la créatinine. De plus, la recherche des métabolites des anti-oestrogènes nécessite une hydrolyse enzymatique qui libère des hormones (éthiocholanolone et androstérone) de polarité proche de celle des principaux métabolites hydroxylés du tamoxifène (Annexe IX). Ces dernières, présentes en concentration élevée dans les urines mâles, risquent donc de coéluer avec les métabolites recherchés. Cette difficulté est contournée grâce à une préparation d’échantillon rigoureuse.

Les deux méthodes de préparation d’échantillon habituellement utilisées sont l’extraction liquide-liquide (Liquid-Liquid Extraction, LLE) et l’extraction solide-liquide (Solid-Phase Extraction, SPE).

a) Extraction liquide-liquide (LLE)

L’extraction liquide-liquide a été fréquemment utilisée comme méthode de préparation d’échantillons biologiques (plasma, urine) contenant des métabolites du tamoxifène. Cette méthode est à la fois économique et simple à mettre en œuvre.

Après hydrolyse enzymatique des métabolites glucuro-conjugués urinaires du tamoxifène, les molécules obtenues sont apolaires (les calculs réalisés avec le logiciel Pallas – CompuDrug (Budapest, Hongrie) donnent des valeurs de log P comprises entre 7 et 7,5 pour le tamoxifène et le 4-hydroxytamoxifène).

Un solvant apolaire tel que le pentane (ou l’hexane) a été utilisé pour l’extraction du 4-hydroxytamoxifène de l’urine avec un rendement de l’ordre de 40 % [9]. L’ajout d’un modificateur polaire tel que le butanol ou l’isopropanol (2–5% v/v), aussi capable d’interagir par liaisons hydrogène, améliore l’extraction avec un recouvrement de 84 % lors de la préparation d’un échantillon de plasma humain [17,23]. L’extraction par du diéthyl éther, solvant capable de créer des interactions dipôle-dipôle plus fortes que l’hexane ou le pentane, a été réalisée sur de l’urine [8] ou du sérum équin (recouvrement supérieur à 70 %) [18].

Chapitre III – Application des polymères à empreintes moléculaires au clean-up d’un échantillon aqueux : cas d’un dopant dans les urines

Le tableau III.7 indique les caractéristiques des principaux solvants utilisés en LLE selon Hildebrand et Rohrschneider. Dans chaque cas, le paramètre est donné soit de façon globale ou de façon détaillée afin de mieux évaluer les interactions dipôle-dipôle et les liaisons hydrogène déployées entre les molécules de solvant et le 4-hydroxytamoxifène.

Solvant δ (cal1/2cm-3/2) P’ δn (cal1/2cm-3/2) Pn δh (cal1/2cm-3/2)

hexane 7,3 0,1 0,0 ⁄ 0,0 pentane 7,0 ⁄ 0,0 ⁄ 0,0 diéthyl éther 7,4 2,8 1,4 1,4 2,5 butanol 11,4 3,9 2,8 2,8 7,7 isopropanol 11,5 3,9 3,0 3,0 8,0 eau 23,4 10,2 7,8 2,6 20,7

Tableau III.7 : Paramètres de solubilité des solvants selon Hildebrand et de polarité selon Rohrschneider [Annexe I].

δ:paramètre de solubilité selon Hildebrand ; P’ : polarité des solvants selon Rohrschneider ; interactions dipôle-dipôle (δn , Pn) ; liaisons hydrogène (δh).

Le tamoxifène (pKA ≈ 8,8) est majoritairement sous forme ionique au pH de l’urine après ajout d’une solution tampon phosphate (pH 6) favorable à l’hydrolyse enzymatique. Or, le caractère ionique du tamoxifène diminue son rendement d’extraction par les solvants peu polaires usuellement utilisés en LLE.

b) Extraction solide-liquide (SPE)

A l’heure actuelle, l’analyse des métabolites du tamoxifène retrouvés dans les urines d’athlètes dopés [1,11] et de femmes sous traitement préventif du cancer du sein [26] met en place une étape initiale de SPE sur phase stationnaire apolaire (C₁₈ : Waters Sep-Pak Plus, Varian Bond Elut C₁₈ ou styrène-divinylbenzène : Rohm & Haas Amberlite XAD-2) avant l’étape d’hydrolyse enzymatique. Dans chaque procédure, l’urine portée à pH 7 est déposée directement sur la cartouche SPE. Les étapes de lavage diffèrent selon les protocoles :

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1) SPE A

(dopage [1,11])

B

(traitement préventif du cancer du sein [26])

Dépôt ^{urine diluée}

dans un tampon phosphate pH 7

urine diluée

dans un tampon phosphate pH 7

Lavage(s) H2O 1) tampon phosphate pH 7, 10 mM 2) CH3OH / H2O 50-50 (v/v) 3) CH3OH (V < 1 mL) Elution CH3OH CH3OH 2) LLE (après hydrolyse enzymatique) échantillon (pH 9) / hexane ou diéthyl éther

Dans le protocole A, le lavage à l’eau a un pouvoir éluant insuffisant vis-à-vis d’un certain nombre de molécules présentes dans la matrice urinaire, et des molécules endogènes moyennement polaires se retrouvent totalement dans la phase d’élution. Une étape supplémentaire d’extraction liquide-liquide (hexane ou diéthyl éther) extrait alors les anti-oestrogènes et les molécules d’hydrophobie équivalente.

Le protocole B permet de préconcentrer l’échantillon en 4-hydroxytamoxifène d’un facteur 5 avec un rendement proche de 100 %. La fraction d’élution est analysée par électrophorèse capillaire. L’électrophérogramme obtenu présente une ligne de base exempte de pics interférents à des temps de migration proches de celui du 4-hydroxytamoxifène [26].

Les deux protocoles permettent l’élimination des espèces ioniques et/ou polaires de l’urine, mais aucun n’est suffisamment spécifique pour éliminer les molécules endogènes de polarité proche de celle du tamoxifène.

Récemment, des polymères à empreintes moléculaires du tamoxifène ont été préparés afin de tester leur spécificité [28-30].

Une étude menée par B.A.Rachid [28] a permis d’évaluer un polymère à empreintes moléculaires du tamoxifène. Plusieurs lavages organiques ont été testés révélant la sélectivité du matériau par comparaison des recouvrements obtenus sur le MIP et sur le NIP. Les applications sur du plasma et de l’urine non hydrolysée ont montré un faible pic de la matrice polaire sans qu’aucun rendement d’extraction n’ait été mentionné. D’autre part, le relargage

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important du tamoxifène lors de l’étape d’élution interdit tout dosage du tamoxifène à de faibles concentrations.

Dans une seconde étude, P.D.Martin [30] a préparé un MIP à partir du tamoxifène et a montré la faible affinité du MIP vis-à-vis de sa molécule empreinte. Paradoxalement, un MIP préparé à partir du propranolol offre une affinité suffisante vis-à-vis du tamoxifène pour envisager une extraction spécifique de cette molécule contenue dans une matrice complexe. Les auteurs devaient tenter d’expliquer ce résultat par modélisation moléculaire, à ce jour, aucune nouvelle étude n’a été publiée.

Ces premiers résultats publiés ont semblé suffisamment encourageants pour étudier de façon approfondie la synthèse et les caractéristiques d’un MIP du tamoxifène et pour l’appliquer à l’urine hydrolysée d’un sportif dopé. Afin d’éviter les problèmes d’interférence dus au relargage de la molécule empreinte, nous avons réalisé la synthèse du MIP avec un analogue chloré du tamoxifène, le clomiphène.

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