Application à l’analyse d’un extrait hydrolysé de racines de réglisse

a) Mise au point du protocole SPE

Le précédent protocole SPE (Tableau II.5) a été appliqué à un extrait hydrolysé de racine de réglisse (Annexe VI). Toutefois, dans une expérience préliminaire, la matrice polaire n’ayant pas été totalement éliminée lors du lavage au chloroforme, ce dernier a été remplacé par l’acétonitrile. En effet, le fort pouvoir éluant de l’acétonitrile sur des molécules polaires déposées sur un MIP (monomère MAA) a déjà été démontré avec l’atrazine [44]. Les valeurs de polarité partielle (p_n) selon Snyder et Rohrschneider montrent que l’acétonitrile (p_n (ACN) = 2,436) est davantage apte à créer des interactions dipôle-dipôle fortes que ne l’est le chloroforme (p_n (CHCl₃) = 1,353) [45]. D’autre part, le caractère dissociant élevé de l’acétonitrile (ε_r = 37,5) affaiblit les liaisons hydrogène existant entre les molécules interférentes ou recherchées et le polymère [46].

Lors de l’étape de lavage, le caractère éluant de l’acétonitrile et la trop faible masse (60 mg) de MIP ont entraîné une forte perte d’Ac-β-Gly. L’acétonitrile a donc un pouvoir éluant fort vis-à-vis de l’Ac-β-Gly. De plus, la reconnaissance de l’Ac-β-Gly par les empreintes n’est pas favorisée car l’acétonitrile n’est pas le solvant porogène. Aussi, une masse de 200 mg de MIP a été introduite dans la cartouche SPE de façon à augmenter le nombre de sites de rétention de l’Ac-β-Gly. Le nouveau protocole d’extraction est reporté dans le tableau II.6.

Etape Composition du mélange Volume (mL)

Conditionnement ^{1) MeOH} 2) ACN

6 12 Dépôt ^{Extrait hydrolysé de racine de réglisse (1 mg / 3 mL)}

dissous dans ACN ^0,5

Lavage ACN 1,5

Elution MeOH 2

Tableau II.6: Protocole SPE sur MIP (200 mg) appliqué à un extrait hydrolysé de racine de réglisse.

Les chromatogrammes obtenus par CPL–UV (254 nm) pour l’analyse de l’extrait hydrolysé de racine de réglisse avant et après SPE sur MIP sont superposés dans la figure II.16.

Chapitre II : Application des MIPs au clean-up d’un échantillon organique : cas des extraits de plante

Figure II.16: Superposition des chromatogrammes obtenus pour l’analyse d’un extrait hydrolysé de racine de réglisse avant (pointillés) et après (trait plein) SPE sur MIP (* : pic non identifié). Analyse par CPL-UV (254 nm).

L’étape de lavage permet d’éliminer 93 % de la matrice polaire (valeur déterminée grâce à la mesure de l’aire du massif de la matrice (CPL-UV (220 nm)), résultat non présenté). L’étape d’élution donne un recouvrement de 98 % pour l’Ac-β-Gly. Ce résultat est très satisfaisant si on le compare à celui obtenu lors de la préparation d’un extrait de racine de réglisse sur cartouche HLB (recouvrement 77 %) [47].

b) Evaluation de la capacité du MIP pour la préparation d’un extrait hydrolysé de racines de réglisse

Nous avons évalué, dans le paragraphe II.2.2.b, la capacité du MIP à 2 µmole d’Ac-β-Gly par gramme à partir d’une solution standard d’Ac-β-Gly. Il convient de déterminer cette capacité en présence de la matrice contenue dans la racine de réglisse. Ainsi, un volume de 1,5 mL d’une solution d’extrait hydrolysé de racines de réglisse (1 mg, 3 mL ACN) est déposé sur deux cartouches SPE, d’une capacité volumique de 3 mL, et respectivement remplies de 200 mg de MIP et 200 mg de NIP. Les autres étapes du protocole sont identiques à celles reportées dans le tableau II.6. Chaque fraction est évaporée à sec sous azote et dissoute dans 0,5 mL de méthanol pour être analysée par CPL – UV (254 nm). Le tableau II.7 reporte les

0 0,3 0,6 1 2 3 4 5 6 7 te m ps (m in) s ignal (AU) matrice polaire * Ac-β-Gly

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Quantité d’Ac-β-Gly (nmole) MIP NIP

déposée 251,5 251,5 1) perdue au dépôt 2) perdue au lavage 3) éluée 251,5 - 244,2 = 7,3 107,4 139,7 251,5 - 238,5 = 13 206,4 39 Recouvrement global (%) 101 102,7

Tableau II.7: Bilan en quantité de matière pour l’Ac-β-Gly lors du protocole SPE appliqué au MIP et au NIP.

Les quantités d’Ac-β-Gly éluées par le méthanol (139,7 nmoles pour le MIP et 39 nmoles pour le NIP) montrent une capacité plus élevée pour le MIP que pour le NIP. Bien que le MIP et le NIP retiennent les mêmes quantités d’Ac-β-Gly lors du dépôt, une part importante (82 %) de la molécule recherchée est éluée du NIP au lavage.

L’essentiel des composés constituant la matrice est éliminé du MIP et du NIP au cours de l’étape de lavage (résultats obtenus par analyse CPL-UV à 220 nm, mais non montrés). Ceci prouve que la rétention matrice – polymère est principalement due à des interactions non spécifiques.

La quantité maximale d’Ac-β-Gly retenu spécifiquement par 200 mg de MIP est de 100,7 nmoles (139,7 – 39), soit 0,5 µmol/g de MIP avec un volume de dépôt de 1,5 mL. Ainsi, cette quantité spécifique retenue par le MIP est inférieure à la capacité obtenue avec une solution standard (2 µmol/g, dépôt et lavage au chloroforme). Tout en tenant compte de la différence de volume déposé sur la cartouche, supérieur à celui utilisé lors du tracé de la courbe de capacité (p.78), la diminution de la capacité du MIP est, en partie, imputée à l’effet matrice même si les constituants de cette dernière sont principalement retenus par des interactions non spécifiques. De plus, l’acétonitrile a un fort pouvoir éluant et n’est pas le solvant porogène du MIP, autant de facteurs peu favorables à la rétention de l’Ac-β-Gly par les empreintes du MIP.

II.2.4. Conclusion

Un MIP (monomère fonctionnel MAA) a été préparé pour l’extraction d’un triterpène, l’Ac-β-Gly appartenant à la famille des oléananes, dans un extrait de plante. Après optimisation du

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protocole SPE, la réactivité du MIP vis-à-vis de quatre triterpènes de la même famille a été évaluée, démontrant l’importance de la position des groupes fonctionnels des solutés capables d’interagir avec les fonctions acide carboxylique de l’acide méthacrylique.

Ces résultats montrent que le MIP synthétisé est bien adapté à l’extraction spécifique de l’Ac-β-Gly et de son épimère.

La détermination de la capacité du MIP pour une solution standard d’Ac-β-Gly et pour un extrait naturel a été réalisée. Le protocole SPE a été appliqué à un extrait hydrolysé de racine de réglisse avec un recouvrement très satisfaisant de 98 %.

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II.3) PREPARATION ET EVALUATION D’UN POLYMERE A EMPREINTES MOLECULAIRES D’UN