Récemment, de nouvelles méthodes ont été développées afin d’enrichir les connaissances sur cet organe acteur clé de santé humaine mais auparavant négligé. Il s’agit d’outils moléculaires indépendants des techniques de culture. En effet, l’arrivée de l’identification et caractérisation des bactéries par séquençage de la petite sous unité ribonucléique ribosomique 16S (ARNr 16S) a permis une étude phylogénétique et taxonomique de la communauté microbienne .
Parmi les méthodes basées sur l’analyse de l’ARNr 16S, on retrouve entre autres :
o Méthode de pyroséquençage permettant un séquençage rapide et à moindre cout que celui généré par la méthode de Sanger car elle ne nécessite pas de clonage, donc une lecture directe de la séquence obtenue après séquençage. Il permet une analyse globale du microbiote intestinal et une meilleure résolution taxonomique puisque l’identification peut atteindre un genre ou une espèce.
o Méthode d’empreintes génétiques générant un profil d’acide désoxyribonucléique (ADN) de communauté microbienne dans chaque échantillon .Cet approche est essentiellement utilisée à des fins de comparaison en se basant sur l’électrophorèse en milieu dénaturant (DGGE) qui dénature le gène amplifié par PCR ,et sur le polymorphisme de longueur des fragments de restriction terminaux (TRFLP)mais cette technique présente une limite de détection élevé.
o Technologie de puces à ADN spécialement basée sur l’hybridation et conçu pour le criblage à haut débit de communauté microbienne. Les régions codant pour l’ARNr 16S sont amplifiées par la réaction de polymérase en chaîne (PCR), marquées par fluorescence puis mises en contact avec des sondes de fragments d’ADN connue. La
fluorescence résultant de cette hybridation est détectée et l’intensité du signal représente le niveau d’expression du gène correspondant.
o la PCR quantitative et l’hybridation in-situ couplée à la cytométrie en flux pour analyse de résultats (FISH : Fluorescent In-Situ Hybridization) : ces techniques accordent une identification de bactéries recherchées à l’aide de sondes spécifiques et posent donc des limites dans le cas de l’identification de nouvelles espèces bactérienne [6].
2.3-Métagénomique :
Cette technique représente l’avancée la plus récente dans le développement de l’analyse du microbiote intestinal, elle permet un séquençage direct de l'ADN microbien extracté à partir d'un environnement donné sans obligation d’étape d’amplification préalable suivi d’un assemblage et d’une analyse bio-informatique du ou de génomes séquencés .Cette technique nous renseigne sur la diversité et l’abondance relative de la population microbienne, également nous fournit une prédiction partielle sur les fonctions réalisés par les différents gènes [7]. Ainsi, malgré les progrès considérables que la métagénomique a permis pour étendre la définition du répertoire, une grande partie de ce dernier, dénommée usuellement la «dark matter » et qui correspond à un nombre incalculable de séquences nucléotidiques n’étant assignées à aucun microorganisme connu, résiste à cette avancée technologique et demeure totalement inconnue [8].
D'autres techniques d'analyse des protéines (métaprotéomique), et des métabolites (métabolomique) se sont également améliorées et ont été appliquées dans des études sur le microbiome et la comparaison des différents profils protéiques et métabolique des échantillons. La combinaison des résultats de ces différentes approches peut aider à élucider les rôles écologiques des microbes dans notre corps, ce qui a suscité l’intérêt des chercheurs et industriels à lancer différents programmes pour l’étude du microbiome humain :
o Le consortium Human Microbiome Project (HMP) lancé par le National Institutes of Health des États-Unis qui s’intéresse à la caractérisation des communautés microbiennes dans le corps humain ainsi que leur relation avec la santé et les maladies humaines en comparant les bases les données de bases du microbiote d’adultes «en bonne santé» à celle des patients.
o Le consortium européen du METAgenomics of the Human Intestinal Tract (Meta-HIT) lancé par la commission Européenne qui permet d’étudier de manière approfondie les gènes microbiens dans l'intestin humain et leurs relations avec la maladie, afin de comprendre les mécanismes de développement de la maladie, principalement les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin (MICI) et l'obésité [9].
3-Composition :
Il est aujourd’hui admis que chaque individu a sa propre signature microbienne qui s’installe depuis la naissance et qui se modifie tout au long de la vie. En effet, l’analyse métagénomique du microbiote intestinal a permis de classer les individus en 3 grands phylas bactériens [10]:
o Les Firmicutes : il est le plus abondant, représenté par les bactéries à Gram Positif (Clostridium leptum, Foecalibactérium prausnitzii, Enteococcus foecalis…)
o Les Bacteroidetes : ils partagent la dominance avec les Firmicutes et présentent 10 à 30% des bactéries totales représenté par les espèces du genre Bacteroides qui sont des bactéries sous forme de bacille gram négatif anaérobie et le genre Prevotella.
o Les Actinobacteria : il est moins détecté que les 2 premiers groupes et représente en général moins de 10 % des bactéries totales, représenté par celles du genre Bifidobacterium.
En outre, Ils ont aussi pu caractériser des espèces de Proteobacteria contenant l‘ordre des Entérobacteriales qui sont des bactéries anaérobies facultatives que l‘on identifie en faible quantité, ainsi que des représentants des Streptococques et Lactobacilles [11].
La flore digestive comprend aussi des Archaea, l’espèce Methanobrevibacter smithii étant clairement la plus représentée, divers protozoaires (surtout des amibes, par exemple des espèces Entamoeba dispar, Entamoeba hartmanni, Entamoeba moshkovskii, Endolimax nana ou Iodamoeba butschlii et des levures, avec surtout des représentants du genre Candida [12].
Figure 2 : Arbre phylogénétique représentant les différents sous-ensembles (phyla) des groupes bactériens composant le microbiote intestinal [14]
4-Fonctions :
Il est désormais reconnu mondialement que le microbiote intestinal joue un rôle primordial dans notre santé, il peut même être considéré comme un véritable organe caché à part entière. Il a été avéré depuis longtemps pour sa contribution à notre approvisionnement énergétique en raison de la fermentation des résidus indigestes par les enzymes digestives (principalement les fibres), le microbiote intestinal a également subvenu à nos besoins en vitamines et en micro-constituants. Plus récemment, le rôle du microbiote dans le développement et la maturation du système immunitaire est révélé [13].