Méthodes microbioloaiques nouvelles testées

• Pétrifilm (Société 3 M Santé ) : ce test est constitué d'un double feuillet ; le film

inférieur sert de support à un milieu de culture et à un agent gélifiant. Le film supérieur est enduit d'un gel soluble à l'eau froide et d'un indicateur qui colore les colonies. Les deux films sont perméables, optimisant ainsi la diffusion de l'oxygène durant le développement des micro-organismes.

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L'ensemencement est réalisé par dépôt de 1 ml de la suspension-mère ou d'une dilution décimale, au centre du film inférieur. Le film supérieur est alors rabattu et l'inoculum est réparti à l'aide d'un diffuseur plastique. L'eau contenue dans l'échantillon

réhydrate les composants et forme entre les deux films, une gélose de 20 cm2 . Cette

gélification s'obtient en 2 minutes.

Pour le Pétrifilm / flore totale, le milieu de culture utilisé est le PCA (Plate Count Agar), l'indicateur redox utilisé pour faciliter la numération des colonies est le chlorure de triphényltétrazolium (TTC); celui-ci vire au rouge lors de sa réduction par les micro-organismes. De plus, il diffuse lentement et n'inhibe pas la croissance des germes. Les colonies apparaissent rouges et sont comptées après une incubation de 48-72 heures à 30°C.

Le Pétrifilm / conformes représente les mêmes caractéristiques que celui de la flore totale, avec les spécificités suivantes : le milieu de culture utilisé est le VRBL (gélose biliée lactosée au cristal violet et au rouge neutre). L'incubation dure 24 heures à 30°C (pour les conformes totaux) ou à 44°C (pour les conformes fécaux). Les colonies apparaissent rouges avec des bulles de gaz dues à la fermentation du lactose.

Le Pétrifilm / levures et moisissures est basé sur le même principe que les deux précédents. Il contient un milieu de culture de type OGA (gélose glucosée à l'oxytétracycline) ainsi que des antibiotiques (chloramphénicol et chlortétracycline) qui inhibent la croissance des bactéries contaminantes. La composition de l'agent gélifiant a été étudiée pour limiter les phénomènes d'envahissement. La numération des levures et des moisissures est facilitée par la présence d'un indicateur coloré, le 5 bromo- 4 chloro- 3- indoxyl- phosphate (BCIP) qui donne un précipité bleu en présence de phosphatase (enzyme produite majoritairement par les levures et les moisissures). Après 3 à 5 jours d'incubation à 20 ou 25°C, les levures forment de petites colonies bleu/vert ou blanchâtres, alors que les moisissures sont de taille plus importante et donnent des pigmentations noires, jaunes ou vertes, selon la moisissure considérée.

Notons que le Pétrifilm / levures et moisissures n'a pas fait l'objet de cette étude comparative entre méthodes classiques et nouvelles, étant donné qu'il n'était pas encore commercialisé au moment de la réalisation de cette étude. Il a cependant été utilisé dans la suite des travaux, suite à l'efficacité prouvée du Pétrifilm / flore totale et du Pétrifilm / conformes.

• Test Tecra ( Vitek Systems, USA, commercialisé par la Société 3 M Santé ) : basé sur une réaction immuno-enzymatique de type ELISA, il permet la détection des salmonelles grâce à l'utilisation d'anticorps hautement purifiés. Il se compose d'une microplaque constituée de cupules sécables les unes des autres, au fond desquelles sont fixés les anticorps spécifiques. Ce test nécessite les opérations préalables suivantes :

pré-enrichissement dans de l'eau peptonée tamponnée (18-22 h à 37°C) ;

enrichissement dans du bouillon sélénite-cystine (16 h à 37°C) ;

post-enrichissement dans du bouillon M préchauffé à 37°C (16 h à 37°C) ;

* "thermisation" (15 minutes à 100°C).

L'échantillon "thermisé" est alors introduit dans la plaque Tecra, et additionné de réactifs spécifiques. En 2 heures, la présence d'antigènes spécifiques de salmonelles dans l'échantillon analysé est indiquée par une coloration verte visible à l'oeil nu et évaluée grâce à un comparateur de couleur. Il faut signaler que ce kit facilite l'étape d'isolement par épuisement et d'éventuelles confirmations sur galeries API, mais il nécessite les différentes étapes classiques (citées plus haut dans ce paragraphe) d'enrichissement. D'ailleurs, jusqu'à présent, aucun test de détection des salmonelles ne permet de s'affranchir de ces étapes préliminaires, d'où la relativité de l'appellation "kit rapide".

• Microtest A (Société France Organo Chimique ) : ce test est constitué d'une lame à double face quadrillée. La face claire contient de la gélose PCA (Plate Count Agar) et un indicateur coloré, le chlorure de triphényltétrazolium (TTC), pour la numération de la flore totale. La face foncée contient une gélose au malt pour la numération des levures et moisissures. La lame est trempée dans la suspension ou dilution à tester, puis elle est égouttée et replacée dans son boîtier pour incubation (48-72 h à 30°C). Les colonies des germes mésophiles (flore totale) sont colorées en rouge ; les levures sont rondes, de couleur beige ou blanche, et les moisissures apparaissent en forme de colonies de "poils" largement étalées. Le nombre de bactéries est évalué par comparaison à une table de référence livrée avec le kit.

• Microtest SR (Société France Organo Chimique ) : ce test est constitué d'un tube

contenant un milieu gélosé permettant la réduction du sulfite en H2S. L'ensemencement

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légèrement sur du papier absorbant puis à l'enfoncer dans le tube gélosé qui sera bouché et incubé 48 h à 37°C. Le développement des sulfito-réducteurs est caractérisé par la formation de sulfure de fer noir. La coloration noire peut apparaître à n'importe quel endroit du tube. Son intensité dépend du degré de contamination. Les résultats ne sont pas quantitatifs mais approximatifs. L'utilisation de ce test est cependant assez délicate, surtout dans le cas de germes pathogènes, compte tenu des nombreuses manipulations du capillaire et du risque de contact avec la suspension microbienne analysée.

• Test Spectate (May-Baker, Glasgow, Ecosse, commercialisé p a r les Laboratoires

Humeau ) : le test est composé de 2 réactifs qui sont des mélanges de suspensions de latex

rouge, bleu et vert. Chaque couleur correspond à une sensibilisation du latex avec un anticorps spécifique d'un groupe de Salm onella . Le test est réalisé sur les zones-test (cercles) d'une carte réactionnelle. Une goutte de chaque réactif est ajoutée à une goutte de la suspension à analyser ( soit le bouillon d'enrichissement, soit une colonie remise en suspension dans une solution saline NaCI 0,9%). Le tout est mélangé avec un stick en bois et bien étalé dans la zone-test, puis agité sur un agitateur rotatif pendant 4 minutes. En présence de salmonelles, le latex sensibilisé avec l'anticorps spécifique au groupe de cette salmonelle va s'agglutiner avec apparition d'un croissant coloré et changement de la couleur de fond. Le test est également réalisé sur des témoins positifs (réactifs latex contenant des suspensions de bactéries mortes).

• Biocontrol 1-2 Test (Biocontrol Systems Inc., USA, commercialisé p a r A E S

Laboratoires ) : ce test est une méthode qualitative de détection rapide des salmonelles

mobiles dans les produits alimentaires. Il est constitué d'un dispositif à usage unique en matière plastique, composé de 2 chambres. La plus petite, ou chambre d'inoculation, contient un bouillon d'enrichissement sélectif au tétrathionate, additionné de vert brillant et de L-sérine. La plus grande, ou chambre de migration, contient un milieu semi-solide peptoné non sélectif. Les deux chambres sont reliées par une ouverture. La partie supérieure de la chambre de migration comporte un espace contenant des anticorps H polyvalents (flagellaires).

La réalisation du test consiste à ensemencer 0,1 ml du bouillon d'enrichissement à analyser et d'incuber le dispositif 24 h à 37°C. Cet inoculum va subir un enrichissement sélectif dans la chambre d'inoculation, puis les salmonelles mobiles présentes vont se déplacer à travers un milieu de mobilité non sélectif (chambre de migration) ; et enfin, elles seront immobilisées par les anticorps anti-H flagellaires. Cette immobilisation des

salmonelles aboutit au développement d'une bande de cellules ou "immunobande", visible à l'oeil nu, au sein du milieu de mobilité. La forme de l'immunobande est comparée à un témoin positif ou négatif.

• Millipore (Millipore Corporation ) : L'échantillonneur Millipore est constitué de 2 membranes ; l'une extérieure est un filtre dont les pores ont un diamètre de 0,45 |i.m, et l'autre intérieure, est un tampon contenant le milieu nutritif. Un évent est incorporé à la partie supérieure arrière de la languette. Cette configuration permet d'aspirer par

capillarité, 1 ml de la suspension ou dilution à analyser, à travers le filtre qui retient les

micro-organismes à sa surface. Le tampon est ainsi réhydraté et le milieu de culture diffuse à travers les pores du filtre, fournissant alors aux micro-organismes les composés nécessaires à leur développement. L'échantillonneur ensemencé par aspiration capillaire est ensuite remis dans son boîtier plastique et mis à incuber à 30°C pendant 24 h (pour les conformes), 48 h (pour la flore totale) et 72 h (pour les levures et moisissures). Le comptage des colonies est facilité par le quadrillage du filtre.