Méthodes expérimentales

III.2.3.1. Préparation des liposomes

Les liposomes sont des structures de forme sphérique constituées de phospholipides formant une ou plusieurs bicouches phospholipidiques concentriques organisées autour d’un compartiment aqueux. Les liposomes utilisés possèdent différentes compositions :

1) 26,6% PC, 26,6% PE, 26,6% SM, 20,2% CHOL (w/w) (Liposomes non chargés)

2) 30% PC, 30% PE, 2,5% PI, 10% PS, 5% SM, 22,5% CHOL (w/w) (Liposomes chargés)

a) Les liposomes multilamellaires (MLV)

Pour réaliser des MLV, un film lipidique doit être formé. Les phospholipides sont dissous dans une solution de chloroforme /méthanol 2/1 (vol/vol). Le ballon est placé au rotavapor (rotavapor ; Van Der Heyden Büchi, Suisse) pour le soumettre à une évaporation sous vide. Le film est ensuite disposé dans un dessicateur pendant 24 heures. Pour former les liposomes multilamellaires, le film lipidique est réhydraté avec du tampon et incubé une heure dans un bain-marie à 37°C avec agitation au vortex toutes les dix minutes. Le tampon utilisé dépend des mesures à effectuer.

b) Les liposomes unilamellaires de grande taille (LUV)

Les LUV sont préparés à partir des MLV. Ces derniers sont soumis à 5 cycles de congélation/décongélation. Ensuite, la solution subit 10 passages successifs dans un extrudeur (extruder Lipex Biomembranes, Vancouver, Canada). Lors de ces passages, sous l’impulsion d’une pression d’azote de 20 bars, la solution doit traverser deux filtres de polycarbonates (Polycarbonates filters Lipex Biomembranes, Vancouver, Canada) superposés, dont les pores présentent un diamètre de 100 nm.

c) Les liposomes unilamellaires de petite taille (SUV)

Les SUV sont préparés à partir des MLV et présentent un diamètre inférieur à 100 nm. Les MLV sont soumis à 5 cycles de sonication de 2 minutes (puissance de 0,5 Watts) (High intensity Ultrasonic Processor, Sigma Chemical Co. St Louis, Missouri, USA). L’échantillon est refroidi dans un bain d’eau et de glace pour éviter que la température de l’échantillon ne s’élève lors de la sonication. Ensuite, une centrifugation de 10 minutes à 2000 g permet d’éliminer les fragments de titane provenant de la sonde (Biofuge Pico, Van Der Heyden, Heraeus, Allemagne).

III.2.3.2. Détermination de la concentration en phospholipides

Le dosage des phospholipides est effectué par la méthode de Bartlett (Bartlett G.R., 1959). L’échantillon est séché et les phospholipides sont minéralisés à 200°C pendant 45 minutes par ajout d’acide perchlorique. Lors de cette étape, le phosphore organique est transformé en phosphate minéral. Ce dernier va pouvoir être dosé par ajout de molybdate d’ammonium, générant de l’acide phosphomolybdique et de l’acide aminonaphtylsulfonique (AANS), composé coloré dont l’absorbance est mesurée à 830 nm par spectrophotométrie (Spectrophotomètre lambda 40 UV/Vis Perkin-Elmer, Norwalk, CT, USA). La concentration de l’échantillon est déterminée en comparant son absorbance à celle d’un étalon.

III.2.3.3. Mesures de fusion de phase lipidique

Pour mesurer le phénomène de fusion, un fluorophore lipophile, le chlorure d’octadécylrhodamine (R18), est utilisé. Ce marqueur est capable de s’insérer parmi les phospholipides et lorsqu’il se retrouve à une concentration suffisamment élevée dans les membranes, sa fluorescence est masquée. Tout processus conduisant à une diminution de sa densité de surface va s’accompagner d’une augmentation de fluorescence. Un mélange de liposomes marqués et non marqués est mis en présence du peptide. Si ce dernier est fusogène, la fluorescence augmente car la densité de surface du fluorophore diminue (Figure 34).

Figure 34 : Schéma explicatif de la fusion de phase lipidique.

25µl de peptide (concentration allant de 60µM à 1200µM) et 300µl de liposomes marqués (50µM) sont ajoutés à 1200µl de liposomes non marqués de même concentration. Un échantillon contenant uniquement le peptide et les liposomes marqués est également mesuré. Cette mesure permet d’éliminer l’augmentation de fluorescence qui n’est pas associée au phénomène de fusion. La contribution du solvant dans lequel est dissous le peptide (HFP/TFE, TFE, DMSO) est également mesurée. La fluorescence relative du marqueur R18 est mesurée durant 15 minutes. La dernière mesure est utilisée pour les représentations graphiques et la fluorescence observée en l’absence de peptide est soustraite. Pour considérer qu’il y a fusion, cette différence doit être supérieure à 100. Pour ces mesures, les films lipidiques sont réhydratés avec du tampon 1.

La fluorescence est mesurée par un spectrofluorimètre Perkin-Elmer LS-50B (Norwalk, CT, USA) et les longueurs d’ondes d’excitation et d’émission sont respectivement de 560 nm et de 590 nm.

III.2.3.4. Mesures de perméabilité lipidique

La capacité d’un peptide à perméabiliser la membrane lipidique est mesurée par l’atténuation de la fluorescence de l’HPTS par le DPX. Lorsque ces deux molécules sont suffisamment proches, il y a atténuation de la fluorescence de l’HPTS par le DPX par un phénomène de “quenching” (Ellens H. et al., 1986). Lors du test de perméabilité lipidique, ces

molécules sont encapsulées dans les mêmes liposomes pour masquer la fluorescence de

Emission de fluor e scence Em issi on de fl uor escence

l’HPTS. Si il y a perméabilisation de la membrane, une augmentation de l’intensité de fluorescence sera observée (Figure 35).

Figure 35 : Schéma explicatif de la perméabilité lipidique.

L’HPTS et le DPX sont encapsulés dans le compartiment aqueux des mêmes liposomes lors de la formation des LUV ou des SUV (voir III.2.3.1.), les films lipidiques étant réhydratés avec 1ml de tampon Tris-HCl pH 7,4 (tampon 2), 1ml de solution d’HPTS 37,5mM (45mM en NaCl) et 1ml de solution de DPX 135mM (20mM en NaCl). Pour réaliser les mesures, 25µl d’échantillon sont ajoutés à 750µl de liposomes marqués. Les références 0% et 100% sont obtenues en ajoutant respectivement 25µl de tampon et 25µl de Triton X- 100. Le Triton X-100 est un détergent qui perméabilise totalement les membranes. Ensuite, les peptides à des concentrations allant de 60µM à 1200µM et les solvants utilisés sont testés. La fluorescence de l’HPTS est mesurée durant 15 minutes. La dernière mesure est utilisée pour les représentations graphiques. La fluorescence observée en l’absence de peptide est soustraite.

La fluorescence est mesurée par un spectrofluorimètre Perkin-Elmer LS-50B (Norwalk, CT, USA) et les longueurs d’ondes d’excitation et d’émission sont respectivement de 450 nm et de 512 nm. Les résultats se présentent sous la forme de pourcentage de sortie de l’HPTS. Ce dernier se calcul à partir de la formule :

X(t) – X(0)

% =

X(100)– X(0)

x 100

X(0) = fluorescence observée après l’ajout de 25µL de tampon

X(100) = fluorescence observée après l’ajout de 25µL de Triton X-100

III.2.3.5. Mesures de cytotoxicité

a) Culture cellulaire

Les cellules humaines de neuroblastome SH-SY5Y, gracieusement fournies par le professeur Nigel M. Hooper, ont été cultivée dans un milieu “Dulbecco’s minimum Eagle medium (DMEM)” (Life Technologies) contenant de la L-alanyl-Lglutamine (862mg/L) et du pyruvate de sodium (110mg/L) auquel a été ajouté 10% de sérum fœtal de bœuf (FBS) (Life Technologies) et 1% de pénicilline/streptomycine (Life Technologies) ; les cellules ont été maintenues à 37°C dans un incubateur humidifié sous 95% d’air et 5% de CO2. Pour les

expériences, les cellules ont été maintenues dans un médium DMEM sans FBS contenant le supplément de croissance pour neuroblastome N2 (Life technologies) et 1% de

pénicilline/streptomycine.

b) Test de viabilité cellulaire

Les peptides lyophilisés ont été dissous dans du tampon PBS (phosphate-buffered saline) stérile à la concentration de 1mM (solution stock) et les aliquots fraîchement préparés ont été stockés à –20°C jusqu’à utilisation. Pour les expériences de toxicité cellulaire, les peptides ont été dissous dans le milieu de culture pour atteindre la concentration désirée (25µM à 400µM), juste avant d’être ajoutés aux cellules.

Les cellules humaines SH-SY5Y ont été ensemencées dans des plaques de culture 96 puits (GREINER) puis incubées à 37°C sous atmosphère humide contenant 95% d’air et 5% de CO2 afin de permettre l’adhérence des cellules à la surface du puits. Seize heures après, le

milieu a été remplacé par un milieu sans sérum contenant 1% de N2-supplement et les cellules

ont été traitées pendant 24h avec les concentrations indiquées de peptide.

La viabilité cellulaire a été mesurée en utilisant le test d’activité métabolique “cellTiter 96 AQueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay” (Promega). Le principe du test est basé

sur la réduction du tétrazolium du MTS (3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-5-(3- carboxyméthoxyphényl)-2-(4-sulfophényl)-2H-tétrazolium) en présence d’un coupleur d’électrons (phénazine méthosulfate; PMS) en formazan. Au niveau cellulaire, cette réduction est principalement réalisée par l’action de la déshydrogénase du succinate cytoplasmique et mitochondriale.

A la fin du traitement expérimental, 20µl d’un mélange MTS/PMS ont été ajoutés dans chaque puits. La plaque a été incubée pendant 2h à 37°C et 5% CO2/95% d’air et à l’abris de

la lumière. La quantité de formazan produit a été estimée par mesure de l’absorbance à 490nm (EL 312e microplate Bio-Tek Instruments). Tous les tests MTS ont été reproduits trois fois en triplicata. Les graphiques reprennent les déviations standard obtenues à partir de ces neuf observations.

III.2.3.6. Mesures de dichroïsme circulaire

La mesure de la différence entre les coefficients d’extinction de deux lumières polarisées circulairement à droite et à gauche est appelée dichroïsme circulaire. Toute molécule optiquement active possède un dichroïsme circulaire. Pour qu’une molécule soit optiquement active, elle ne doit posséder ni centre, ni plan, ni axe de symétrie. Chaque acide aminé naturel à l’exception de la glycine, possède un carbone α asymétrique. La présence de ces Cα est à l’origine de l’activité optique et donc du spectre de dichroïsme circulaire que possède une séquence peptidique. Quelles que soient leurs structures, tous les peptides possèdent un spectre de dichroïsme circulaire. Cependant, la structure du peptide (angles de torsion différents selon la structure secondaire) exerce une influence sur la position et l’intensité des pics constituant le spectre CD. Celui-ci est donc caractéristique des structures secondaires contenues dans un peptide ou dans une protéine (Greenfield N. et al., 1969 ; Chen

Y.H. et al., 1974 ; Yang J.T. et al., 1986).

Une hélice α est caractérisée par trois pics à 193, 207 et 222 nm. Pour une hélice droite, les deux pics à 207 et 222 nm sont des minima et celui à 193 nm est un maximum, tandis que pour une hélice gauche, les extrema sont inversés. Les feuillets β sont caractérisés par deux bandes dont une est centrée à 215-218 nm et une à 195 nm, respectivement négative et positive. Les coudes β donnent lieu à une grande diversité de spectres rendant difficile leur interprétation. Néanmoins, le spectre d’une molécule structurée en coude β montre généralement deux bandes, une négative autour de 205 nm et une positive centrée autour de 220 nm. La conformation random coil est caractérisée par un minimum vers 198 nm et une bande d’amplitude variable, positive ou négative, vers 220 nm.

Les spectres CD ont été enregistrés sur un spectromètre CD Jasco J-815 avec des cuvettes de quartz de 10 mm de chemin optique. 10 scans ont été enregistrés et automatiquement moyennés pour des longueurs d’ondes comprises entre 190 et 250 nm. La structure secondaire des peptides a été déterminée en utilisant le programme CDpro, qui inclut

les méthodes CDSSTR, SELCON3 et CONTINLL (Sreerama N. et al., 2000). Ces méthodes

effectuent des décompositions du spectre suivant les bandes caractéristiques des différentes structures secondaires à partir d’un jeu de protéines globulaires de référence. Les pourcentages de structures secondaires correspondent à la moyenne des pourcentages fournis par ces trois méthodes. Les solutions stock de peptide utilisées pour ces mesures ont été diluées dans du tampon Tris 1mM pH 7,4 (tampon 3) ou dans du TFE pour atteindre la concentration de 10µM. En ce qui concerne les mesures effectuées en présence de liposomes, les concentrations peptidique et lipidique sont respectivement de 5µM et 25µM, ce qui donne un rapport peptide/lipide de 0,2.

IV. Résultats