Méthodes de détection rapide des bêta-lactamases à spectre étendu

Il existe des méthodes de détection rapide des BLSE impliquant techniques moléculaires (Multiplex ESBL, Check-MDR CT102, Check-MDR ESBL), de méthode de détection biochimique rapide (BLSE NDP test) ainsi que la spectrométrie de masse (MALDI-TOF MS).

L'avantage et l'intérêt de ces techniques sont qu'elles fournissent des résultats définitifs dans la même journée contrairement aux 24 heures nécessaires à l'analyse des méthodes phénotypiques classiques.

II.3.1. Détection moléculaire rapide des BLSE

La détection rapide des BLSE fait intervenir aussi des techniques moléculaires impliquant des gènes des BLSE. Les méthodes utilisées sont diverses (Multiplex ESBL, Check-MDR CT102, Check-MDR ESBL…).

1- Multiplex ESBL

Le système de test Multiplex BLSE est un outil de diagnostic qualitatif pour la détection de bactéries productrices de divers BLSE.

La Multiplex BLSE détecte toutes les entérobactéries possédant un ou plusieurs gènes (blaTEM, blaSHV, blaCTX-M, blaCoxa) importants responsables de la synthèse de BLSE [83] .

Principe

La PCR Multiplex BLSE contient des amorces oligonucléotidiques marquées qui permet simultanément, l'amplification spécifique de différentes régions d'ADN lors d'une seule réaction de PCR.

En présence de l'ADN correspondant, des produits d'amplification spécifiques de tous les variants des gènes blaTEM , blaSHV , blaCTX-M , et blaOXA sont synthétisés et ensuite visualisées avec par le Multiplex ESBL.

L'hybridation complémentaire des séquences produites sont ensuite détectées par ELISA. Après plusieurs étapes de lavage, une peroxydase (POD) conjugué est ajoutée.

Après de supplémentaires étapes de lavage, la solution de substrat est ajoutée qui produit une couleur bleue lors de la conversion par POD.

Cette réaction est stoppée à l'aide d'une solution d'arrêt. Un virement de couleur au jaune est observé, ensuite mesuré au photomètre à une longueur d'onde de 450 nm.

Des signaux positifs indiquent une amplification spécifique de certaines séquences d'ADN par la Multiplex PCR ESBL et donc la présence des gènes correspondants dans l'échantillon [83] .

2- Check-MDR CT102

La Check-MDR CT102 est conçue pour la détection moléculaire rapide d'un grand nombre de gènes importants de bêta-lactamases chez les bactéries Gram négatives. Ce test détecte des gènes de BLSE (TEM, SHV et CTX-M) et ceux de carbapénèmases ( KPC, NDM, OXA-48, VIM et IMP). La Check-MDR CT102 génère des résultats définitifs dans la même journée contrairement aux 24 heures nécessaires à l'analyse des méthodes phénotypiques classiques. Les informations sur le typage des gènes donne des informations supplémentaires en cas d'épidémies [84] .

Figure 31: A) Tube CP Array (AT) et B) Lecteur de contrôle du tube CP Array [84] .

3- Check-MDR ESBL

La Check-MDR ESBL est conçue pour la détection moléculaire rapide des gènes BLSE. Les gènes CTX-M les plus répandues sont détectés. Ce test génère des résultats définitifs dans 4 à 5 heures, contre 24 heures nécessaires à l'analyse des méthodes phénotypiques classiques [85] .

Principe

La Check-MDR ESBL est fondée sur la reconnaissance moléculaire spécifique de séquences cibles par sonde d'ADN suivie par la détection PCR en temps réel. L'étape de reconnaissance utilise deux oligonucleotides spécifiques qui sont s'appariés par une ADN

ligase uniquement lorsqu'ils sont complémentaires à seulement quand ils correspondent parfaitement à l'ADN cible. En plus des séquences-cibles spécifiques, les sondes d'ADN contiennent deux sites de liaison d'amorces universelles ainsi que d'un segment d'ADN qui est complémentaire d'une balise moléculaire. Après amplification en temps réel avec des amorces universelles sont utilisées pour détecter les sondes complémentaires, et leur accumulation est visualisée par fluorescence [85] .

II.3.2. Détection biochimique rapide des BLSE: BLSE NDP test

Le test BLSE NDP (Nordmann / Dortet / Poirel ) est un test de détection biochimique rapide a qui récemment été mis au point. Ce test est basé sur la détection colorimétrique de l’hydrolyse du céfotaxime, inhibée en présence de tazobactam. Son principe est fondé sur les propriétés d'acidification générées par l'activité des enzymes bêta-lactamases en présence de l'antibiotique [64].

Ce test rapide (< 20 min) permet de détecter la majorité des BLSE à partir des colonies poussant sur milieux usuels ou même directement sur certains prélèvements cliniques [64].

En effet, ce test été développé pour une identification rapide de BLSE dans les entérobactéries. Ce test biochimique a été basé sur la détection in vitro d'une céphalosporine hydrolysée qui est inhibée par l'addition de tazobactam. L'activité de BLSE a été mise en évidence par un changement de couleur (du rouge au jaune) d'un indicateur de pH (rouge de phénol) en raison de la formation de groupes carboxyle de l'acide résultant de l'hydrolyse céfotaxime qui a été inversée par l'addition de tazobactam (test positif) [86].

A l'heure actuelle, ce teste peut être réalisé sur des bactéries isolées dans les urines d'une infection déclarée ou sur des bactéries présentes dans les selles. Le résultat est obtenu en moins de 2 heures.

Ce test présente aussi l'avantage d'être appliqué au lit de malade et permet donc l'optimisation de l'antibiothérapie surtout dans les pays en voie de développement où les taux de résistance sont très élevées. La spécificité de ce test est excellente (100 %) et la sensibilité est variable selon la classe de BLSE produite (50 à 85 %) [86].

Figure 32: A. Principe du ESBL NDP test. B. Résultat du ESBL NDP test [86].

II.3.3. Détection par spectrométrie de masse des BLSE : MALDI-TOF MS

La détection directe des déterminants de la résistance est restée inaccessible parce que de nombreuses protéines impliquées dans la résistance aux antibiotiques tels que les bêta-lactamases, ne sont souvent pas exprimées à des niveaux élevés par rapport à d'autres protéines bactériennes. Cela rend pratiquement impossible d'identifier et de différencier les protéines bêta-lactamase du reste du spectre de la protéine. Une solution à cette question peut impliquer l'utilisation d'un spectromètre de masse MALDI-TOF pour détecter les métabolites produits à la suite de la réaction d'hydrolyse de la bêta-lactamase plutôt que la bêta-lactamase elle-même [87].

Quand une bêta-lactamase s'accroche à un antibiotique du type bêta-lactame, elle augmente la masse moléculaire de la bêta-lactame par plusieurs daltons. Lorsque la réaction d'hydrolyse est terminée, la masse de l'antibiotique hydrolysé est de 44 Da inférieure à celle au début de la réaction. Comme le montre la Figure 34, cette variation de la masse à la suite

Figure 33: Procédure de détection des métabolites de bêta-lactamase par spectrométrie de masse MALDI-TOF MS [87].

Chapitre 7:Prévention