Les méthodes par amplification génique sont des techniques de biologie moléculaire rapides qui détectent les mutations corrélées à la résistance par amplification des gènes les plus souvent impliqués suivie d’hybridation à des sondes porteuses des mutations. Elles permettent une initiation du traitement plus rapide par rapport aux méthodes phénotypiques. En 2008, l’OMS a approuvé l’utilisation du test Line Probe Assay (LPA) (Hain life Science technology) pour la détection de la résistance à la Rifampicine/Isoniazide et plus tard aux antibiotiques de seconde ligne (MTBDRplus V1 et V2, MTBDRsl). Le test de GeneXpert MTB/RIF (Cepheid Sunnyvale, USA), un test automatisé à base de cartouches permettant une analyse entièrement automatisée d’échantillons cliniques, a été reconnu par l’OMS également. Hormis ces trois tests, il existe d’autres techniques de détection : le Séquençage par Sanger ou
38 le pyroséquençage des gènes de résistance, le séquencage du génome entier, associé à l’analyse bioinformatique, le High Resolution Melting Temperature, la MLPA, l’Allele Specific Primer Extension, SNP-typing sur microbilles en cytomètre en flux Luminex200 (qui permettent le typage des SNP responsables des différentes résistances aux antituberculeux au sein des gènes correspondants). Tous ces tests ont le même but, le diagnostic prédictif rapide de résistance. Dans la suite, nous présenterons le principe, les cibles précises, la sensibilité et la spécificité de ces techniques.
Test d’hybridation inverse sur bandelettes (MTBDR plus, Hain LifeScience) Le principe de ce test est basé sur l’amplification multiplexée de fractions de gènes codants pour la cible des antituberculeux suivie d’une hybridation avec des sondes correspondant aux gènes sauvages ou mutés présents sur la bandelette (Fig.7). Il est utilisé sur des cultures ou des échantillons positifs à l’examen microscopique et les résultats sont fournis en quelques heures. Ce test est subdivisé en deux sous-tests, un pour identifier la résistance à la Rifampicine/Isoniazide et l’autre pour la détection de résistance à la Fluoroquinolone, Amikacine, Kanamycine, Capréomycine et Ethambutol. La deuxième version du test, Geno Type MTDRplus 2.0 évaluée en zone endémique, montre une sensibilité de 90% et 93.5% pour la Rifampicine et l’Isoniazide. La deuxième génération du deuxième test de Hain, Geno Type MTDRsl destiné à diagnostiquer la tuberculose XDR, détecte les résistances aux différents antituberculeux avec une sensibilité allant de 68 à 95% (FLQ-95%, AMK-83%, KAN-91%, CAP-82%, EMB-68%) ((Yan Feng, Sijun Liu et al. 2013), (Brossier, Guindo et al. 2016)).
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Les test GeneXpert MTB/Rif, GeneXpert MTB/Rif Ultra et Xpert XDR Les tests GeneXpert sont des tests semi-quantitatifs de PCR en temps réel qui permettent de réaliser dans une seule cartouche les différentes étapes d’extraction, purification, amplification d’ADN, hybridation des sondes et une détection multiplexée. Le test de GeneXpert MTB/Rif (Cepheid, Inc, Sunnyvale, CA, USA) est un test automatisé qui permet de détecter en 90 min M. tuberculosis ainsi que la résistance à la Rifampicine avec une grande précision dans les échantillons cliniques. Ce test a été recommandé par l’OMS à la place de la microscopie, la culture, la culture avec antibiotique (DST) comme test de diagnostic initial chez l’adulte ou l’enfant suspect d’une tuberculose multirésistante ou associée au VIH. Le test GeneXpert MTB/Rif a une sensibilité de 94% et une spécificité de 98% (Steingart KR, Schiller I et al. 2014). Mais ce test a une faible sensibilité pour détecter la tuberculose difficile à diagnostiquer dans les populations à risques (enfants et personnes vivant avec le VIH). Afin d’améliorer la détection de la résistance à la rifampicine, l’OMS recommande le nouveau test « Next – Generation Xpert/MTB Rif Ultra » pour remplacer le Xpert MTB/Rif ((WHO 2017); (McKenna 2017)). La sensibilité du test Ultra (Cepheid Sunnyvale, USA) à détecter la résistance à la rifampicine est meilleure et a montré des performances significativement meilleures par rapport à la cartouche Xpert® MTB / RIF actuelle pour la détection de M. tuberculosis dans des échantillons avec un faible nombre de bacilles, en particulier des échantillons à frottis négatif et à culture positive comme ceux provenant des personnes co-infectées par le VIH (Dorman, Schumacher et al. 2018), des échantillons pédiatriques et des échantillons extra-pulmonaires (Bahr, Nuwagira et al. 2018). Un autre test « Xpert XDR » de Cepheid pas encore approuvé par l’OMS, permet de détecter la résistance à l’Isoniazide, à la Fluoroquinolone, et aux antituberculeux injectable de 2ème ligne avec une sensibilité de INH-98.1%, FQ- 95.8%, KAN-92.7%, AMK- 96.8% ; et une spécificité de INH-98.1%, FQ- 95.8%, KAN-92.7%, AMK- 96.8% par rapport au séquençage ((Boehme 2017); (Lessem 2017)).
Séquençage / le séquençage de génome entier (WGS)
Le séquençage permet la détermination de la séquence nucléotidique, donc la mise en évidence des modifications génétiques responsables d'une résistance par comparaison avec la séquence de bacilles sensibles. Les résultats sont rapides mais coûteux en terme de matériel et d’analyse, cette technique est aujourd'hui applicable en routine grâce à l'utilisation d'automates de séquençage. Le séquençage automatique, contrairement aux techniques
40 précédentes, permet d'analyser des petites régions d'ADN (150 bp à 1 000 bp selon la technologie). Par exemple avec le séquenceur de nouvelle génération (NGS) de Illumina HiSeq X, en trois jours on peut séquencer un génome humain (http://dridk.me/ngs.html). Le séquençage de génome entier, aujourd’hui plus accessible permet non seulement la détection et l’identification de MTBc dans les échantillons cliniques mais aussi favorise le diagnostic des souches MDR/XDR (Louise J Pankhurst, Carlos del Ojo Elias et al. 2016). L’analyse des données de séquençage requiert des outils bioinformatique performant. Le TBProfiler, un outils bioinformatic permettant de prédire la résistance, est concordant avec le DST pour les antituberculeux et démontre d’une haute performance par rapport à l’outil Mykrobe ((Phelan, O'Sullivan et al. 2016)).
Ainsi, le séquençage et/ou séquençage de génome permettent de prédire la résistance ou la sensibilité des souches MTBc aux antibiotiques, et servent ainsi de guide pour le traitement des patients avec un scénario de résistance bacillaire difficile.