Le génotypage est une technique qui analyse des locus variables et hypervariables, et/ou des polymorphismes de nucléotides simple (SNP). Ce type de technique peut aider à étudier la transmission des souches au sein d’une population. Hormis le séquençage partiel ou du génome complet, les méthodes de génotypage de M. tuberculosis utilisées sont le IS6110-
47 RFLP, le spoligotypage et le typage MIRU-VNTR, l’analyse des régions de différences et du polymorphisme de nucléotides simples.
Figure 11 : Marqueurs de génotypage des souches de Mycobacterium tuberculosis (Barnes and Cave 2003).
1.3.1 IS6110-RFLP
IS6110 est un élément génétique mobile spécifique dans le génome de MTBc chez d’autres mycobactéries testées (Dominique Thierry, Anne Brisson-Noel et al. 1990). Très peu de souche de MTBc sans insertion IS6110 ont été reportées. Le nombre de copies et les sites d’emplacement de l’insertion IS6110 varient d’une souche à une autre. La méthode de RFLP (Restriction-Fragment-Lenght-Polymorphism) sur la séquence d’insertion IS6110 (IS6110- RFLP) est une méthode de génotypage basée sur le polymorphisme (polymorphisme causé par des délétions ou duplications) du nombre de copies de IS6110 et de leurs sites d’insertion dans le génome du complexe M. tuberculosis. Le principe est de séparer sur gel d’agarose l’ADN digéré par une enzyme de restriction (PvuII) puis de révéler les fragments porteurs de IS6110 par hybridation selon la méthode de Southern (Fig 12).
Les souches typiques de M. tuberculosis ont dans leur génome une ou plusieurs copies d’IS6110 (jusqu’à 25 copies). La souche bovine M. bovis a en général un nombre faible de
48 copies (1 à 2 copies d’IS6110). Dans les souches de M. tuberculosis et M. bovis, une copie de IS6110 est toujours présente dans la zone du locus CRISPR.
Figure 12 : Exemple de résultat de IS6110-RFLP. a, b, c, d, e, f indiquent les fragments de la
souche H37Rv porteurs de IS6110 révélés par Southern (Barnes and Cave 2003).
Cette méthode a longtemps été la méthode de génotypage de référence de MTBc pour l’épidémiologie moléculaire, mais elle est très laborieuse, son pouvoir discriminant est médiocre pour les souches qui comportent un faible nombre de copies de IS6110 ; elle exige par ailleurs de grandes quantités d’ADN. Le fait que l’Europe ait choisi comme souche de référence Mt14323 tandis que les USA conservaient H37Rv, que la technique soit laborieuse à mettre en œuvre, n’a pas facilité l’interchangeabilité des résultats IS6110-RFLP entre laboratoires. Ainsi la méthode IS6110-RFLP a été remplacée progressivement par la combinaison spoligotypage et MIRU-VNTR ((Dick Van Soolingen, Lishi Qian et al. 1995), (Barnes and Cave 2003), (Supply, Allix et al. 2006), (Aze, Sola et al. 2015)).
1.3.2 Typage des espaceurs dans le locus CRISPR –
Spoligotypage
Le spoligotypage est une méthode de génotypage par PCR et hybridation inverse basée sur le polymorphisme du locus CRISPR ((Kamerbeek, Schouls et al. 1997)). Le locus CRISPR est une suite de séquences répétées identiques d’environ 21 à 48 bp espacées par des espaceurs (spacers en anglais) de séquences uniques (variant en 26 et 72 bp). Ce type de séquence est présent dans environ 40% des eubactéries et dans plus de 90% d’archébactéries
49 ((Grissa, Vergnaud et al. 2007; Grissa, Bouchon et al. 2008)). Dans le complexe
Mycobacterium tuberculosis, il existe un seul locus CRISPR dont la séquence répétée fait 36
bp et la taille des espaceurs varie entre 35 et 41 bp. Il n’acquiert plus de nouveaux espaceurs et son évolution se fait par délétion (délétion de blocs distincts d’espaceurs) soit par recombinaison homologue entre les DR adjacents ou distants soit par transposition d’éléments IS6110 ((Hancock 1995), (Fang, Doig et al. 1999)). Ce marqueur est polymorphe (présence ou absence d’espaceurs) chez MTBc avec une certaine stabilité et sert de marqueur de génotypage. Sur cette base, au cours du spoligotypage, des sondes sont hybridées à des amplicons chevauchant des espaceurs (produits par PCR) (Fig. 13). Cette méthode est utile pour les études évolutives et d’épidémiologie portant sur M. tuberculosis, qu’il s’agisse de déterminer si la transmission est fortuite (« casual ») ou de ménage (« household ») dans les populations (Barnes and Cave 2003). Mais, elle n’est pas suffisamment discriminante pour être utilisée seule comme méthode d’investigation épidémiologique. Elle est donc toujours associée à d’autres méthodes, le plus souvent le typage MIRU-VNTR.
Figure 13 : Le spoligotypage (Bernes et al 2003)
1.3.3 Typage MIRU-VNTR
Les MIRU (Mycobacterial Interspersed Repetitive Units) sont des éléments aussi dits VNTR ou minisatellites (séquences Répétées en Tandem de 40-100bp en Nombre Variable, en anglais Variable Number Tandem Repeats) dispersés dans les régions géniques ou inter- géniques du génomes MTBc. Le typage MIRU-VNTR est basé sur le polymorphisme des loci VNTR. Le principe consiste en une amplification par PCR des VNTR avec des amorces
50 flanquantes spécifiques à chaque locus. Après amplification, les fragments sont analysés par électrophorèse pour déterminer la taille de chaque amplicon (Fig 14). En fonction de la taille du fragment décelé, un nombre de répétitions est attribué à chaque locus. Un ensemble de 12, 15 ou 24 loci VNTR permettent le génotypage de Mycobacterium tuberculosis (Supply, Allix et al. 2006). L’utilisation de 24 loci augmente le nombre de types de profils de 40% et de 23% en combinaison avec le spoligotypage comparé à ceux obtenus par 12 loci. La valeur prédictive pour l’évaluation de la transmission de M. tuberculosis à base de 15 locus discriminants est égale à celle du typage par IS6110-RFLP. Ainsi le schéma à 15 loci a été proposé comme standard pour la discrimination épidémiologique en routine des isolats de M.
tuberculosis et les 24 locus comme outils de typage à haute résolution pour les études
phylogénétiques (Supply, Allix et al. 2006). Le typage de 24 locus VNTR reste assez laborieux à mettre en pratique et l’analyse des résultats longue et sujette à erreurs.
Figure 14 : Méthode de génotypage MIRU-VNTR, A-loci MIRU-VNTR contenus dans le génome de H37Rv, B- électrophorèse sur gel d’agarose d’amplicons de loci VNTR pour 3 souches (BCG, H37Rv, X), C- interprétation phylogénétique de résultats de MIRU-VNTR (Valcheva, Mokrousov et al. 2008).
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1.3.4 Analyse des régions de délétions
La présence ou absence de larges séquences (souvent dites « séquences ou régions de délétion ») constitue des marqueurs spécifiques pour la caractérisation, la classification des souches de M. tuberculosis dans les lignées (Tsolaki A. et al 2005). Ces délétions dans les mycobactéries sont des évènements irréversibles, car il n’y a pas de transfert horizontal de gènes chez M. tuberculosis. Une première étude a identifié 68 régions de déletion dans les isolats du complexe M. tuberculosis. En se basant sur les régions de déletion, six lignées de