1. Introduction
1.2. Méthodes analytiques contemporaines
Actuellement, diverses méthodes analytiques permettent la détection de molécules sécrétées par des cellules. Les défis de détection, associés aux faibles concentrations d’analyte libéré par les cellules pour un court laps de temps, peuvent facilement être relevés en utilisant des méthodes électrochimiques comme l’ampérométrie, la voltampérométrie ou la microscopie électrochimique à balayage (SECM)23-25. Les capteurs électrochimiques, pouvant être
positionnés près des sites de libération des cellules et miniaturisés afin de minimiser les dommages physiques aux cellules26, permettent la détection de molécules électro-actives.
Typiquement, les capteurs électrochimiques sont utilisés pour l’analyse de superoxydes27,
d’espèce réactive de l’oxygène (ROS)28, ou encore de neurotransmetteurs monoamines telles la
DA, la sérotonine (5-HT), l’épinéphrine (EP) et la norépinéphrine (NE)29. Leur détection par
voie électrochimique est néanmoins difficile, puisque plusieurs interférents moléculaires présents dans des matrices biologiques s’oxydent dans des plages de potentiels similaires. Par exemple, l’acide ascorbique (AA), l’acide urique (UA) ainsi que EP s’oxydent tous à des potentiels similaires à celui de la DA, entrainant la superposition des signaux en voltampérométrie30-31. Bien que l’électrochimie soit la méthode standard pour l’analyse de
neurotransmetteurs, son utilisation demeure limitée puisqu’elle requiert un analyte électro-actif dans la plage de potentiel étudiée, et ce, en absence d’interférent en plus d’offrir une faible capacité de multiplexage.
Les acides aminés agissant comme messagers chimiques sont généralement analysés par méthode chromatographique comme la chromatographie liquide (LC)32 ou encore
l’électrophorèse capillaire (EC)33 généralement couplés à la spectrométrie de masse (MS)34.
Contrairement aux méthodes électrochimiques, la LC/EC-MS offre une excellente capacité d’analyse à haut criblage permettant l’analyse simultanée de plusieurs messagers chimiques en plus de permettre leur identification. Néanmoins, ces méthodes souffrent d’une pauvre résolution spatio-temporelle, puisqu’elle requiert le prélèvement local de l’échantillon à l’aide d’une micropipette35-36, ou peuvent nécessiter la dérivation de l’analyte préalablement à sa
détection. Malgré les efforts consacrés au développement de méthodes d’échantillonnage, de dérivation et d’analyse directs afin d’augmenter la résolution spatio-temporelle37, la résolution
temporelle disponible, correspondant à une fréquence d’analyse typique de 0.05 Hz (i.e. 20 secondes entre chaque échantillonnage/analyse)38-39, permet difficilement le suivit des
changements rapides de concentration des messagers chimiques lors d’évènements de sécrétion cellulaire.
Les sécrétions cellulaires peuvent aussi être analysées à l’aide de méthodes spectroscopiques comme la microscopie de fluorescence. Cette dernière est largement utilisée en sciences biologiques afin de mesurer l’activité cellulaire à l’aide de protéine fluorescente génétiquement encodées40-42 sensibles aux flux d’ions Ca2+ et aux ROS43. L’usage de ces
protéines permet entre autres de mesurer l’activité neuronale in vivo et in vitro de manière peu invasive et de manière localisée44. Bien que hautement sensible et offrant une excellente
résolution temporelle, impliquant typiquement une fréquence d’acquisition de 10 Hz40 et une
résolution spatiale pouvant atteindre l’ordre de quelque dizaines de nanomètres45, l’usage de
protéines fluorescentes peut provoquer un changement biochimique au niveau cellulaire pouvant influencer les conclusions biologiques. Aussi, l’usage de protéines fluorescentes ne permet que l’analyse indirecte de messagers chimiques en plus d’être limité à ceux impliquant un flux d’ions Ca2+. La nature des messagers chimiques demeure donc inconnue. La microscopie
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à identifier différents messagers chimiques impliqués dans des évènements de sécrétions cellulaires.
Afin d’être en mesure d’établir un portrait global des mécanismes de signalisation moléculaire du métabolisme cellulaire, une nouvelle méthodologie doit être développée. L’objectif de cette thèse sera consacré au développement d’une technique analytique adaptée aux mesures de métabolites extracellulaires sécrétés par des cellules. En ayant comme principal objectif de combler les lacunes actuelles, cette méthode se doit d’être : non destructive, universelle et nécessitant aucun marquage, permettre l’identification du, ou des, messagers chimiques sondés, être hautement sensible tout en permettant une analyse à haut criblage afin de permettre le suivit rapide et simultanés de divers messagers chimiques lors d’évènements de sécrétion cellulaire. Idéalement, cette méthodologie devra aussi permettre des analyses localisées afin de capturer la libération hétérogène de messagers chimiques, provenant de zone ponctuelle bien précise au sein d’un ensemble de cellules. Par exemple, les neurones dopaminergiques originaires du mésencéphale sécrètent spécifiquement de la DA lors de la transmission synaptique. Ces neurones expriment aussi le transporteur vésiculaire de glutamate (VGLUT)46, indiquant que ces neurones colibèrent le Glu à partir de certaines varicosités
axonales bien précises lors de la transmission. Ce phénotype démontre bien la nécessité d’avoir une méthode capable de sonder l’environnement extracellulaire local, où la composition des messagers chimiques peut varier dans l’espace.
En utilisant les propriétés corpusculaires de la lumière, la spectroscopie Raman, spectroscopie vibrationnelle basée sur la collision inélastique entre un photon et une molécule, permet l’identification de l’espèce moléculaire. Il peut être difficile de représenter de manière empirique une équation montrant l’intensité de diffusion Raman. Néanmoins, l’équation suivante (Éq. 1.1) met en relation les divers facteurs moléculaires ayant un impact sur la puissance de rayonnement de la diffusion Raman ΦR47:
𝛷𝑅 ∝ 𝜎(𝑣𝑒𝑥)𝑣𝑒𝑥4𝐸0𝑛𝑖𝑒−𝐸𝑖⁄𝑘𝑇 (Éq. 1.1)
Où σ(νex) correspond à la section efficace de diffusion Raman à la fréquence d’excitation νex, E0
se trouvent au niveau vibrationnel initial i et le terme exponentiel est le facteur de Boltzmann pour l’état énergétique i.
La section efficace de diffusion Raman σ(νex) par molécule se situe généralement entre
10-31 – 10-29 cm2 sr-1 tandis que la fluorescence offre une section efficace de l’ordre de 10-16 cm2
sr-1, faisant de la spectroscopie Raman une méthode analytique de faible sensibilité48. Pour
pallier au manque de sensibilité du Raman, une source de forte irradiance, comme un laser de haute puissance, peut être utilisée. Aussi, E0 ∝ |𝐸|2 où E correspond à l’intensité du champ
électrique, montrant que l’augmentation locale du champ électrique permettrait aussi d’accroitre l’intensité du signal Raman. Or, certains matériaux possèdent des propriétés physiques permettant de localement augmenter l’intensité du champ électrique.