Méthodes d’étude du cycle de reproduction chez Echinaster sepositus 1 Suivi du développement gonadique (R G S.)

Dans cette étude, la quantification de la reproduction est basée sur le calcul de l’indice gonadique, c'est-à-dire du rapport du poids de la gonade à celui du corps. L’indice couramment utilisé pour les astéries est celui de (Bougis, 1952) ; c'est-à-dire le rapport du poids de la gonade (Pg) à celui du corps (Pt) exprimé en pourcentage (%), définissant ainsi le rapport gonado-somatique.

RGS= Pg/Pt x 100

(Bouchereau, 1981), a utilisé un indice gonado-somatique, définit comme étant égal à 100 fois le poids de la gonade sur la relation propre à l’espèce étudiée, exprimant le poids théorique de l’animal en fonction de la longueur mesurée.

IGS = Pg/Pt x 100 Pt = a x Lb

Dans notre étude, nous avons utilisé l’indice gonadique ou rapport proposé par (Bougis,

56 des 5 gonades chez un individu Pg /poids du corps total humide du même individu Pt en pourcentage. Ce dernier permet de mieux caractériser les périodes de forte augmentation du poids de la gonade.

IG= Pg/Pt x 100

4.1.5.2. Suivi de la maturation des gonades

L’examen histologique (Figure 38) des gonades chez les espèces gonochoriques telles que l’espèce E. sepositus, fournit des informations sur l’état dans lequel se trouve ces organes à des périodes déterminées.

L’étude de la maturation, a été abordée en utilisant deux méthodes complémentaires: l’observation des variations mensuelles du pourcentage de maturité, et l’examen des coupes histologiques des gonades. Les stades de développement ont été différenciés en adaptant l’échelle de définit pour d’autres asteroides.

Figure 38 : Photo montrant la préparation des gonades d’Echinaster sepositus pour les coupes histologiques (Photo : Benzait H.).

57 Au laboratoire, l’étude histologique a été réalisée sur des échantillons d’étoiles de mer, dont les gonades ont été retirées d’une manière régulière (chaque mois un ensemble de cinq à huit individus ont été mesurées, disséquées avec les cinq gonades retirées et immergées dans un liquide fixateur). Les méthodes utilisées pour l’analyse microscopique des gonades sont les méthodes d'histologie classique, en utilisant les colorations topographiques. Nous avons utilisé deux types de fixateurs : le liquide Bouin -eau de mer. Ces fixateurs préparent bien les tissus aux méthodes de colorations de topographie. Les gonades fixées sont ensuite soumises à une série de traitements, dont le but est de préparer l’inclusion à la paraffine non miscible à l'eau des différents tissus de ces pièces. Cette étape comporte trois phases: la déshydratation, l'imprégnation des pièces par la paraffine et l'inclusion proprement dite ou coulage du bloc. La déshydratation se fait dans des bains d'alcool de titre croissant. Par la suite, l'éthanol n'étant pas miscible dans la paraffine, il est remplacé par un solvant : le toluène, liquide intermédiaire. Puis les gonades sont imprégnées à chaud dans la paraffine liquide. Et enfin, des coupes, de 05 à 07μm d’épaisseur sont réalisées à l’aide d’un microtome Américain Optical, après avoir monté le bloc de paraffine dans le porte bloc, les rubans de coupe sont collés sur une lame en verre à l’aide d’une colle biologique à savoir l’eau albumineuse. Après étalement du ruban, chaque lame est identifiée et étiquetée. Le collage et le séchage se fait sur une plaque chauffante à une température de 37° à 40°C. La coloration des lames a été réalisée par une coloration de routine. Une coloration bichromique : hématoxyline éosine, c’est une coloration nucléaire bleue résultant de l’action de l’hémalun et une coloration rouge provenant de l’action de l’éosine (Langeron, 1942).

Le déparaffinage est ensuite réalisé en passant par une succession de bains, d’abord dans un solvant permettant l’élimination de la paraffine (toluène) puis dans des alcools de titre décroissant, de 100° (compatible avec le solvant précédent) jusqu’à 70° (compatible avec l’eau), avant un bain dans l’eau assurant la réhydratation finale.

Après réhydratation, la coupe est colorée. Elle est d'abord plongée dans l’hématoxyline pendant 45 secondes puis rincée à l'eau courante. Par la suite elle est trempée dans l'éosine pendant 10 secondes puis rincée à l'eau courante (Il faut veiller à ne pas décoller la coupe par un courant d'eau trop violent).

Il faut alors procéder à la déshydratation, opération inverse de celle menée au début, avant de pouvoir faire le montage dans la résine (Eukitt). La déshydratation est réalisée en plongeant la lame dans un bain d'alcool à 70° et 95° successivement puis dans un

58 bain d'alcool à 100 et enfin dans deux bains de solvant (xylène), à la sortie du solvant, une goutte de résine de montage (Eukitt) est disposée sur la coupe et une lamelle est appliquée de façon à ce que la résine recouvre l'ensemble de la coupe en orientant la lamelle d’un angle de 30° , puis on dépose cette dernière soigneusement pour éviter la formation des bulles d’air. La préparation est alors prête à l'observation microscopique. A cet effet, en se basant sur l’échelle définit par (Byrne 1997) et adapté à notre espèce on a déterminé les stades microscopiques de maturité sexuelle.

4.1.5.3. Suivi de l’activité trophique

Le suivi de la variabilité temporelle de l’indice du coeca pylorique a été réalisé, car il a été prouvé que seul le coeca pylorique est considéré comme organe de réserve chez les étoiles de mer. Ni les autres organes digestifs ni la paroi du corps (tégument) n'accumulent de réserves d'énergie. Lors d'une digestion d’une durée moyenne (2 à 4 semaines), le contenu du coeca pylorique suffit à assurer la survie de l'animal en libérant leur matière de réserve et en commençant simultanément à s'autolyser. Cet indice a été calculé comme le poids humide du contenu du coeca pylorique /poids du corps entier en pourcentage comme l’ont préconisé (Giese, 1966 ; Ventura et al., 1997 ; Lawrence et Miller , 1999 et Carvalho et Ventura ,2002).

4.1.5.4. Suivi de la température

Selon (Giese, 1959) et(Fuji, 1960), la température est un facteur non seulement jouant un rôle dans le déclenchement de la ponte, mais aussi dans la maturation des gonades. De plus, la température est considérée comme un facteur d'inhibition ou de ralentissement de la nutrition (Smith, 1971). Dans notre étude on a pris en considération la variation de la température pour mieux expliquer la maturation des gonades et le cycle de reproduction, ainsi que l’activité trophique d’Echinater sepositus, La température de l’eau a été obtenue en utilisant une Montre Ordinateur d’apnée multifonction SeacSub Partner

4.2. Etude de l’ophiure Ophioderma longicauda (Retzius, 1789)