Mécanismes effecteurs du rejet de greffe allogénique

a. initiation du rejet

al. ont détecté une augmentation de médiateurs pro-inflammatoires (cytokines, chimiokines ou molécules d’adhésion) lors de greffes cardiaques provenant de donneurs cadavériques conduisant à une accélération du rejet (431). La reperfusion de l’organe déjà endommagé augmente ce phénomène d’inflammation. Ces étapes génèrent en effet des quantités importantes de radicaux oxygénés et de métabolites cytotoxiques (430). Ceci conduit à une altération sévère des tissus et à l’initiation de l’alloréponse. Cette inflammation créée par ces phénomènes d’ischémie/reperfusion semble suffisante pour entraîner la maturation des cellules dendritiques qui sont les principales CPA impliquées dans l’initiation du rejet de greffe (432). De plus, il a été montré que les lésions tissulaires liées à l’ischémie et à la reperfusion sont dépendantes de cellules exprimant le TLR4 et à l’induction locale de

cytokines proinflammatoires et de chimiokines (433). Immédiatement après la greffe, les DC du donneur vont migrer vers les ganglions lymphatiques et la rate du receveur (434). Les ARN messagers (ARNm) des cytokines promouvant la maturation des DC et leur migration comme l’IL-1ß et le TNF-α sont augmentés lors d’allogreffe de cornés dès les premiers jours

suivant la greffe et cette augmentation est aussi observée lors de greffe syngénique (435). Ceci indique que les dommages observés sont apparus avant la greffe. Les DC du receveur, elles, migrent vers le greffon. En effet, ces étapes d’inflammation vont augmenter l’immunogénicité du greffon. Des études réalisées sur le foie, le cerveau, le myocarde et les reins ont montré que l’expression d’ICAM1 et VCAM1 est augmentée à la surface des cellules endothéliales lors des étapes d’ischémie/reperfusion (436, 437). Ces deux molécules jouent un rôle crucial dans le recrutement des leucocytes dans les tissus. Les DC du donneurs capturent alors les alloantigènes et recirculent vers les organes lymphoïdes secondaires. Une fois dans les organes lymphoïdes secondaires, les DC du donneur et/ou du receveur vont présenter les alloantigènes aux lymphocytes T CD4+ du receveur et les activer (Figure 21). L’importance des organes lymphoïdes secondaires dans le rejet de greffe a été mise en évidence par Lakkis et al. qui ont montré qu’un receveur dépourvu d’organes lymphoïdes secondaires accepte spontanément une allogreffe (438). Les cellules endothéliales d’un greffon vascularisé peuvent ainsi jouer un rôle important dans le rejet de greffe en activant directement les lymphocytes T (439).

b. Les lymphocytes T alloréactifs

Après avoir été activés dans les organes lymphoïdes secondaires, les lymphocytes T alloréactifs migrent vers le greffon. L’inflammation créée par l’ischémie/reperfusion

Figure 21. Mécanismes cellulaires de la réponse alloréactive.

a. Les CPA du receveur infiltrant le greffon ainsi que les CPA du donneur vont migrer vers les ganglions lymphatiques où elles vont activer les lymphocytes T par les différentes voies reconnaissances. b. Les lymphocytes T CD4 activés vont aider les lymphocytes T CD8 cytotoxiques et peuvent aussi provoquer une réaction d’hypersensibilité retardée (DTH) médiée par les macrophages activés par la sécrétion d’IFN-γ. Les lymphocytes T CD4 peuvent aussi entraîner la lyse directe via FasL. L’inflammation induite par les éosinophiles, conséquence d’une réponse de type Th2, va aussi endommager le greffon. Les lymphocytes

augmente la sécrétion de chimiokines par les cellules du greffon. Ceci va attirer des neutrophiles, des macrophages et des cellules NK au niveau de la greffe, qui vont à leur tour sécréter des chimiokines. Toutes ces chimiokines attirent alors les lymphocytes T activés (Figure 21).

Les lymphocytes T CD4

Les lymphocytes T CD4 jouent un rôle essentiel dans le rejet de greffe. En effet, des greffes cardiaques ou des greffes de peaux allogéniques sont acceptées de façon permanente chez un receveur déficient en lymphocytes T CD4 (441). De plus, le seul transfert de lymphocytes T CD4, un jour avant la greffe, est suffisant pour induire le rejet du greffon. Une fois activés les lymphocytes T CD4 peuvent se différencier en cellules Th1, Th2 ou Th17.

Dans le cadre du rejet de greffe, la différenciation des lymphocytes T CD4 en Th1 entraîne la différenciation des T CD8 en CTL ainsi qu’une réaction d’hypersensibilité retardée (DTH) avec activation des macrophages et production d’anticorps IgG2a, immunoglobulines capable de fixer le complément (Figure 21). La DTH est caractérisée par un œdème consécutif à l’augmentation de la perméabilité membranaire ainsi qu’à l’infiltration massive du tissu par des lymphocytes T, des macrophages et des neutrophiles (442). Ces cellules sécrétent des cytokines telles que l’IFN-γ et le TNF-α qui vont participer à l’activation des macrophages

qui à leur tour produisent du monoxyde d’azote, des radicaux oxygénés et du TNF-α. Le NO,

métabolite d’azote très réactif, est toxique à haute concentration et entraîne une vasodilatation et un œdème caractéristiques de la DTH. Il a été montré que l’inhibition de la synthèse du NO prolongeait significativement la survie du greffon (443). Le TNF-α s’associe à son récepteur

et entraîner l’apoptose ou la nécrose des cellules cibles via l’activation de la voie des caspases. Les neutrophiles vont sécréter l’enzyme MPO qui convertit le H202 produit suite au burst oxydatif en produits très toxiques pour les cellules (444). Les études cliniques mettent en évidence l’importance de la DTH dans le rejet de greffe allogénique (445, 446). Différents groupes ont appuyé cette idée à l’aide de modèles expérimentaux. Tout d’abord les macrophages sont souvent présents dans les infiltrats leucocytaires des greffes rejetées (423, 447). De plus, l’implication directe des Th1 dans le rejet a été montrée par différents groupes, par l’injection de lymphocytes Th1 chez des souris immunodéprimées (444, 448, 449). Le transfert de cellules est suffisant pour induire le rejet de greffe caractérisé par une infiltration cellulaire de macrophages et de lymphocytes T. Ceci est associé à une forte proportion d’ARNm du TNF-α. Chez l’Homme, une augmentation des ARNm de T-bet, facteur de

transcription spécifique des lymphocytes Th1 est observée lors de rejet aigu de rein (450). De plus, les Th1 peuvent également exercer une activité cytotoxique par les systèmes perforine/granzyme ou Fas/Fas-L (451, 452). Ces mécanismes ont aussi été montré dans le cadre d’alloréactivité, in vitro face à des cibles allogéniques (151, 453). Lors de greffe peau, les greffons provenant de donneurs déficients pour Fas sont moins vite rejetés (454).

Quant à l’IFN-γ, cytokine Th1, il joue un rôle paradoxal dans le rejet de greffe. D’une

part, il favorise l’inflammation du greffon en favorisant la réponse Th1 et d’autre part il semble aussi jouer un rôle régulateur du rejet. En effet, plusieurs groupes ont montré que l’IFN-γ est indispensable à la tolérance du greffon, réduisant l’hémorragie et la nécrose (455),

(456). L’IFN-γ semble prévenir la destruction du greffon médiée par la voie

perforine/granzyme et l’expression des molécules de CMH-I par le greffon est indispensable dans cette protection (457). Sawitzki et al. ont montré que chez des souris déficientes pour l’IFN-γ les capacités régulatrices des lymphocytes Treg alloréactifs étaient fortement altérées

et ces derniers ne sont plus capables de contrôler le rejet de greffe de peau (456). De plus, l’IFN-γ induit une augmentation de l’expression de Foxp3 par les lymphocytes T CD4 naïfs

cultivés en présence de CPA allogéniques et lorsque ces cellules prétraitées à l’IFN-γ sont

injectées à des souris, elles sont capables d’inhiber le rejet de greffe de peau allogénique (458).

Initialement, les lymphocytes Th1 étaient considérés comme les principales cellules effectrices du rejet d’allogreffe alors que les lymphocytes Th2 étaient décrits comme cellules régulatrices du rejet (459). Cependant, différents groupes ont montré, dans des modèles murins de greffe allogénique de peau, cardiaque ou de vaisseaux, que les cytokines Th2 telles que l’IL-4 et l’IL-5 sont responsables à la fois du rejet de greffe aigu et chronique (448, 460- 462). Les premières expériences suggérant un rôle pour les Th2 dans l’induction du rejet d’allogreffe proviennent de modèles murins où la polarisation Th2 est entraînée par la déplétion des lymphocytes T CD8 ou par des antagonistes de l’IL-12. En effet, chez des souris dont les lymphocytes T CD8 ont été éliminés, le rejet aigu a été associé à une augmentation de la production locale d’IL-4 et d’IL-5 avec une infiltration d’éosinophiles (463). Ces résultats ont aussi été obtenus lors d’allogreffe chez un receveur CMH-I compatible ou déficient en lymphocytes T CD8 (448, 461). De même, le blocage de la voie Th1 avec un antagoniste de l’IL-12 n’est pas capable de prévenir le rejet, et une infiltration

déviation de la réponse immune vers un phénotype Th1 ou Th2 est associée à un rejet de greffe mais avec des caractéristiques différentes (465). Les souches génétiquement prédisposées à développer une réponse Th2 font un rejet aigu avec un fort dépôt d’ IgG anti- donneur avec une prédominance d’IgG1.

La preuve directe de l’implication des Th2 dans le rejet de greffe a été apportée par différents groupes qui ont montré que le transfert de lymphocytes T CD4 polarisés en Th2 ou de clones Th2 différenciés in vitro ou encore de clones Th2, chez des souris immunodéficientes induit le rejet de greffe cardiaque, de peau ou d’îlots de pancréas (448, 460, 462) et ce aussi efficacement que les Th1 (449). Des souris doublement invalidées pour l’IL-2 et IFN-γ rejettent rapidement une greffe de cœur allogénique et ce rejet est caractérisé

par une augmentation des IgG1 par rapport aux IgG2a et la présence de cytokines de type 2 à l’intérieur de la greffe (466).

Les lymphocytes Th2 peuvent aussi entraîner le rejet de greffe via l’activation des éosinophiles (Figure 21). De nombreux modèles ont mis en évidence le rôle des éosinophiles dans le rejet de greffe médié par les Th2 (467). En effet, au niveau histologique, le rejet médié par les Th2 est caractérisé par une infiltration d’éosinophiles au niveau du greffon (460, 461, 468). De telles observations ont été relevées aussi chez l’Homme où des infiltrats d’éosinophiles sont constatés dans les biopsies de transplants en cours de rejet, lors de greffes hépatique, rénale, ou cardiaque (469-471). De plus, il a été montré, chez la souris, que la neutralisation de l’IL-4 ou de l’IL-5 ou la déplétion des neutrophiles prévient cette infiltration d’éosinophile et le rejet (454, 461, 472, 473). Les éosinophiles sont recrutés dans la greffe par l’IL-4, l’IL-5 et l’IL-13 produites par les Th2. En effet, l’IL-4 et l’IL-13 vont faire augmenter l’expression de VCAM-1 sur les cellules endothéliales. VCAM-1 interagit avec VLA-4 exprimés par les neutrophiles et permet l’adhésion de ces cellules (474, 475). Ces cytokines augmentent aussi le recrutement tissulaire des éosinophiles en accroissant la production d’éotaxine notamment par les cellules endothéliales (476, 477). L’IL-5 et l’éotaxine vont ensuite recruter et activer les éosinophiles dans le tissu enflammé (478). Les éosinophiles activés relarguent alors des substances nocives qui créent des pores membranaires sur les cellules cibles ainsi que des dommages oxydatifs sur les protéines tissulaires (479).

Les Th17 semblent aussi jouer un rôle dans le rejet de greffe allogénique. Des études ont montré que des antagonistes de l’IL-17 retardent significativement le rejet de greffe (480, 481). Cependant, ces antagonistes de l’IL-17 semblent protéger du rejet aigu mais pas du rejet chronique (482). Chez l’Homme, quelques études reportent une association entre l’IL-17 et le rejet. En effet, de l’IL-17 est détectée chez des patients présentant un rejet aigu (483-485). De

plus, il a été montré que les souris Tbet-/- rejettent leur greffon plus rapidement dans un modèle de vasculopathie chronique d’allogreffe et on observe chez ces souris un « switch »

vers une réponse Th2 et Th17 (486). La neutralisation de l’IL-17 dans ce modèle inhibe cette accélération du rejet. Ces résultats montrent qu’en l’absence de réponse allogénique Th1, les Th17 médient une réponse proinflammatoire agressive dans le cadre du rejet de greffe et des vasculopathies chroniques de greffe. Des cellules différenciées in vitro en Th17 sont capables d’induire une GvHD létale caractérisée par des lésions cutanées et pulmonaires (487). Cet effet semble médié par le TNF-α. De façon surprenante, l’ajout d’anticorps anti-IL-17

n’améliore pas la GvHD dans ce modèle. Le rôle pathogène de l’IL-17 pourrait s’expliquer par sa capacité à recruter les neutrophiles au site du greffon (Figure 21). En effet, les neutrophiles, qui sont rapidement recrutés par la voie IL-17/IL-23, ont largement été décrits dans le rejet d’allogreffe chez l’homme et dans des modèles expérimentaux. Chez l’Homme, l’infiltration de neutrophiles est fréquemment observée dans les biopsies de greffe rejetées et une corrélation a été établie entre le degré d’infiltration des neutrophiles et la sévérité du rejet (488). Chez la souris, la déplétion des neutrophiles retarde l’apparition du rejet lors de greffe de peau (472) ou de greffe cardiaque (489).

Cependant, des données récentes suggèrent que le rôle des Th17 dans l’alloréactivité est un peu plus complexe. En effet, l’injection de lymphocytes T CD4 IL-17-/- dans un modèle de greffe de moelle osseuse chez des receveurs sauvages retarde légèrement l’apparition de la GvHD , mais la mortalité générale n’est pas affectée. Ces souris présentent une diminution des macrophages et de granulocytes sécréteurs d’IFN-γ ainsi qu’une

diminution des cytokines proinflammatoire IL-4 et IL-6. Il semblerait donc que les Th17 ne soit pas importants dans le développement de la GvHD mais contribuent a son développement précoce en promouvant la production de cytokine proinflammatoire.(490). Dans un modèle de GvHD murins, il a été montré que des cellules T CD4 IL-17-/- du donneur se différencient en Th1 avec une augmentation de la production d’IFN-γ et induisent une GvHD aiguë exacerbée.

Lorsque l’IFN-γ est neutralisé chez ces souris, la GvHD est retardée. Ces résultats indiquent

que les Th17 du donneur peuvent inhiber la différenciation Th1 et améliorer la GvHD aiguë chez des receveurs allogéniques (152).

exemple, Rosemberg et al. ont montré que le transfert adoptif de lymphocytes T CD8 effecteurs est suffisant pour induire le rejet de peau incompatible pour le CMH-I chez la souris (491). Une autre étude, dans un modèle de greffe de peau, montre un retard dans le rejet lorsque les lymphocytes T CD8 sont absents (444). De plus, d’autres modèles murins d’allogreffes de peaux ont montré que la déplétion de lymphocytes T CD4 ne suffisait pas à empêcher le rejet (492, 493). Un rôle important a donc été attribué aux lymphocytes T CD8. Par contre, Krieger et al. ont montré que des greffes de peau chez des souris CD8-/- sont rejetées avec la même cinétique que chez des souris sauvages (441) montrant ainsi que les lymphocytes T CD8 ne sont pas nécessaires pour initier le rejet du greffon. Aujourd’hui, il semble clair que les lymphocytes T CD8 cytotoxiques jouent un rôle clé dans le rejet d’organe (Figure 21).

Les CTL sont activés par la reconnaissance du CMH-I du donneur mais ces molécules de CMH sont aussi la cible des effecteurs cytotoxiques matures. L’hypothèse dominante serait que les lymphocytes T CD8 seraient activés par la présentation directe d’antigènes du donneur par les CPA provenant du greffon (494). Bien que les CPA du donneur soient les principales cellules impliquées dans l’induction des CTL, Kreiser et al. ont reporté un nouveau mécanisme de présentation directe des alloantigènes par les cellules endothéliales vasculaires activées du donneur (439, 495). Cette voie peut induire un phénotype effecteur suffisant pour causer le rejet de greffe.

Bien que des études aient montré, à l’aide de souris déficientes pour la perforine ou Fas ou les deux, l’importance de la voie perforine/granzyme et Fas/Fas-L dans la cytotoxicité, des études suggèrent un rôle dominant de la voie perforine/granzyme dans l’induction de l’apoptose dans le rejet de greffe (496). De plus, l’expression de Fas et Fas-L peut-être détectée chez l’Homme dans les greffes rejetées mais leur présence n’est pas spécifique du rejet (497, 498). Krupnick et al. ont montré in vitro que la mort cellulaire de cellules endothéliales vasculaires déficientes pour Fas et FasL induite par les CTL n’est pas affectée (496). De même, lorsque des lymphocytes T infiltrant la greffe rénale humaine subissant un rejet sont incubés en présence de concanamycine A, un inhibiteur de la voie perforine/granzyme, la lyse et l’apoptose des cellules épithéliales tubulaires proximales sont fortement réduites. En revanche, l’incubation avec un inhibiteur de Fas ne diminue pas la mort cellulaire (499). A l’inverse, des études montrent que le rejet peut arriver en absence de perforine (500). Dimaond et Gill ont montré à l’aide de transfert adoptif de lymphocytes T CD8 chez des souris immunodéprimées que le rejet de greffe d’îlots pancréatiques ne dépendait pas de la perforine ni de FasL. Ceci pourrait s’expliquer par le fait que les granzymes peuvent entrer dans la cellule cible par un mécanisme indépendant de la perforine

tel que le récepteur au mannose-6-phosphate cation indépendant. En effet, le blocage de la capture de granzyme B par ce récepteur prévient l’apoptose. Lorsqu’il est injecté à des souris sous la capsule rénale, il prévient le rejet (501).

Ces molécules qui confèrent des propriétés cytotoxiques sont généralement considérées comme inductrices du rejet mais il a été montré que dans certaines conditions elles peuvent jouer un rôle protecteur. Par exemple, il a été suggéré que la perforine provenant des cellules du donneur peut réguler la réponse alloréactive en induisant l’apoptose des cellules du receveur (502). De même, il a été montré que l’expression de Fas-L confère une protection du greffon en induisant l’apoptose via Fas des cellules effectrices du receveur (503, 504).

OBJECTIFS

Chez le rat, l’intensité d’expression membranaire de la tyrosine phosphatase CD45RC, permet de définir deux sous-populations lymphocytaires T CD4 et T CD8 fonctionnellement distinctes. Les lymphocytes T CD4 et T CD8 CD45RChigh

sont responsables du développement de pathologies auto-immunes (wasting disease et thyroïdite) et de réponse alloréactive pathogène (GvHD aiguë et chronique). Par contre, les lymphocytes T CD4 et CD8 CD45RClow possèdent des propriétés différentes puisqu’ils sont capables de réguler ces pathologies.

L’objectif de ma thèse a été d’étudier si, chez l’Homme, le niveau d’expression de CD45RC permettait aussi de définir des sous-populations fonctionnellement distinctes au sein des lymphocytes T CD4 et CD8; et d’analyser l’implication de ses sous-populations dans les pathologies humaines.

Dans un premier temps, nous avons analysé le profil d’expression de la molécule CD45RC au sein de la population T CD4 et CD8 d’individus sains. Afin de déterminer les propriétés fonctionnelles de ces sous-populations, nous avons étudié, la prolifération de ces sous-populations et la sécrétion de cytokines induite en réponse à une stimulation polyclonale. Une analyse de l’expression de marqueurs de différenciation et de cellules régulatrices a permis de mieux caractériser ces sous-populations. Les différences fonctionnelles observées nous ont poussé à étudier l’implication de ces sous-populations dans le développement de maladies auto-immunes. Du fait des cytokines impliquées, nous nous sommes intéressés plus particulièrement aux vascularites à ANCA. Nous avons pour cela analysé le profil d’expression de CD45RC sur une cohorte de patients atteints de cette pathologie.

Par la suite, nous avons étudié les propriétés alloréactives de ces cellules en analysant leur prolifération et leur profil de production de cytokines après stimulation allogénique. Étant donné la grande hétérogénéité inter-individuelle d’expression de CD45RC observé et les différences d’alloréactivité de ces sous-populations nous nous sommes interrogés sur la capacité de CD45RC à servir de marqueur pour prédire le développement d’une pathologie alloréactive qu’est le rejet de greffe allogénique. Dans cet objectif, nous avons analysé le profil d’expression de CD45RC chez des patients avant transplantation rénale et le suivi de ces patients sur une période de 2 à 8 ans après la greffe nous a permis d’étudier les capacités