Le mécanisme de sécrétion des granules lytiques: (Voir figure résumé 28)

a) La formation des granules lytiques: implication de Lyst et Munc13-4

La protéine Lyst est une protéine cytoplasmique non associée aux membranes ou à d’autres compartiments. La mutation de Lyst conduit à la formation de lysosomes géants qui se «  clusterisent  » autour du noyau. Au contraire quand on surexprime Lyst, on observe des lysosomes anormalement petits qui se localisent à la périphérie des cellules. Lyst serait donc impliquée dans la régulation de la fission des lysosomes (Perou 1997). Dans les LTc, on observe la formation d’énormes granules lytiques (2 ou 3 granules géants) qui finissent par s’arrimer à la synapse immunologique de part leur grosseur mais qui ne seront pas sécrétés. La formation de

ces lysosomes géants est engendrée par des évènements de fusion entre les lysosomes de sécrétion. Ces évènements ont lieu continuellement au sein des cellules pour permettre des échanges entre ces compartiments. Cependant ici, il semblerait que les évènements de fission qui conduisent à leur séparation soient altérés, aboutissant ainsi à la formation de granules géants

(Perou 1997; Stinchcombe 2000). De plus, une étude récente réalisée au sein de notre équipe a pu apporter des précisions quand à la nature de ces granules géants. Ces granules géants se seraient formés via la fusion d’endosomes de recyclage (Rab11) et d’endosomes tardifs (Rab7/ Rab27) alors que les endosomes précoces (EEA1) ne fusionnent pas avec ce compartiment. Lyst interviendrait donc dans la maturation terminale du granule lytique. De plus, la formation de ce compartiment empêcherait les effecteurs de l’exocytose comme Munc13-4, Rab27a et Slp3 d’assurer leurs fonctions (leur localisation étant altérée) (Sepulveda 2015).

La protéine Munc13-4 serait aussi impliquée dans la formation du granule lytique. Elle permettrait en effet la fusion entre les endosomes de recyclage et les endosomes tardifs conduisant à la formation d’une vésicule d’exocytose qui fusionnera avec les compartiments lysosomaux contenant la perforine (Menager 2007)(Voies de biogenèses décrites précédemment). b) Le transport terminal et l’arrimage des granules: Rab27a et Munc13-4?

Les granules qui contiennent les enzymes lytiques perforine et granzymes vont se polariser en direction de la synapse immunologique puis s’ancrer à la membrane plasmique par le biais de la molécule Rab27a.

Le syndrome de Griscelli du à la mutation de Rab27a chez l’homme (Menasche 2000) et la souris ashen (Wilson 2000) conduit à un albinisme et à un défaut de cytotoxicité des LTc et cellules NK. En effet, des études de microscopie électronique ont pu démontrer que les granules lytiques, en l’absence de Rab27a, étaient capables de se polariser en direction de la synapse mais en revanche n’étaient pas capables de s’arrimer à la membrane pour être sécrétés (Stinchcombe 2001; Feldmann 2003)(Figure 27).

Figure 27: Microscopie électronique montrant un arrimage normal des granules lytiques (LG)

dans les CTL déficients en Munc18-2 (Gauche) et un défaut d’arrimage des granules lytiques dans les CTL déficients en Rab27a (Droite) (Feldmann 2003)

Plusieurs familles de molécules interagissant avec Rab27a ont été décrites: les protéines Slp, la famille des protéines SLAC2 (Slp homolog lacking C2 domain) et les protéines RBD (Rab3 binding domain). Toutes ces protéines ont la particularité de posséder un domaine SHD (SLP homology domain) en N-ter impliqué dans leur interaction avec Rab27a (sous sa forme GTP)

(Wang 1999; Fukuda 2001; Kuroda 2002). La protéine Munc13-4, qui n’appartient pas à ces familles de protéines, peut elle aussi interagir avec Rab27a grâce à sa partie N-ter (Menager 2007). Par le biais des interactions avec ces différentes protéines, Rab27a va alors pouvoir assurer des fonctions variées.

Rab27a serait d’abord impliquée dans le transport terminal du granule lytique grâce à Slp3

et la kinésine-1 (détails plus loin dans la partie 3b) (Kurowska 2012) puis dans l’ancrage à la membrane plasmique. Cet ancrage serait réalisé grâce différents membres de la famille Slp: Slp1,

Slp2a, et Slp3 qui possèdent des domaines C2 capables de fixer les phospholipides

membranaires. En effet, l’inactivation de ces trois protéines conduit à des défauts d’arrimage et de sécrétion des granules lytiques. A noter que la compensation est possible entre ces partenaires

(Ménasché 2008; Holt 2008). Selon une étude réalisée en 2003, la protéine Munc13-4, un autre partenaire de Rab27a, ne serait pas impliquée dans ces évènements d’arrimage mais interviendrait dans le mécanisme de fusion des granules lytiques (Feldmann 2003)(Figure 27).

Néanmoins une étude réalisée en 2011 indique le contraire, en démontrant que l’interaction entre Munc13-4 et Rab27a serait essentielle à l’arrimage des granules à la synapse (Elstak 2011). Son implication dans l’arrimage du granule est donc encore controversée.

c) La fusion des granules: Munc13-4, Munc18-2 , STX11

La fusion des granules lytiques avec la membrane plasmique pourrait être médiée par la protéine Munc13-4 en induisant l’activation de la molécule STX11 (une t-SNARE). STX11 passerait d’une conformation dite fermée à une conformation dite ouverte grâce à l’action de Munc13-4 sur Munc18-2. En effet le mécanisme déjà décrit au niveau de la synapse du neurone (dans la partie I de l’introduction) pourrait s’appliquer ici au niveau des LTc. En effet, Munc13-4 est capable d’interagir avec les protéines SNARE, grâce à ses domaines C2A et C2B régulés par l’action du calcium, et de médier la formation du complexe SNARE nécessaire à la fusion des granules lytiques avec la membrane plasmique (Boswell 2012). La molécule Munc18-2 est, elle aussi, capable d’interagir avec le domaine Habc et le peptide N-ter de la molécule STX11 pour médier la fusion du granule avec la membrane plasmique (Hackmann 2013). Cette interaction entre Munc18-2 et STX11 serait aussi nécessaire à l’expression de STX11 (Cote 2009). En effet une mutation dans la partie Habc de STX11 qui induit une perte d’interaction entre Munc18-2 et STX11, conduit à un défaut de stabilité de la protéine STX11 et à des défauts de dégranulation (comme au niveau neuronal) (Muller 2014). STX11 serait ainsi la Q-SNARE importante pour les

mécanismes de fusion des granules lytiques. En effet, les granules lytiques sont transportés et fusionnent uniquement là où les clusters de STX11 se sont préalablement formés (Halimani 2014).

Concernant les autres SNARE qui interagissent avec STX11:

Aucune R-SNARE n’a pour le moment était clairement identifiée même si les protéines VAMP8, VAMP7, VAMP3, VAMP4 et VAMP2 sont des candidats potentiels. Néanmoins VAMP7

étant déjà impliqué dans le transport de LAT et des TCR au niveau de la synapse (Larghi 2013;

Soares 2013), le défaut de cytotoxicité observé en l’absence de VAMP7 pourrait s’expliquer par un défaut de signalisation et non par un défaut de formation du complexe SNARE. De même pour

VAMP3 qui a été impliqué dans le transport des TCR (Finetti 2015). VAMP8 ne serait pas

impliquée dans la formation du complexe SNARE même si sa délétion conduit à des défauts de cytotoxicité dans les LTc (Loo 2009) car elle n’interagit pas avec STX11 (Halimani 2014). Cependant, elle serait impliquée dans le transport de STX11 au niveau de la membrane plasmique. STX11 serait en effet localisée dans des endosomes de recyclage Rab11+ et VAMP8+ (comme CD3) et serait recrutée au niveau de la membrane plasmique pour former la plateforme d’arrimage des granules lytiques par le biais de ces endosomes (Halimani 2014; Marsahll 2015). Concernant VAMP2 une étude réalisée en 2013 démontre que VAMP3, VAMP4 et VAMP7 ne colocaliseraient pas avec les granules lytiques (Granzyme B+). Dans les LTc seul VAMP2 serait associé aux granules lytiques (Matti 2013). Ces résultats sont en contradiction avec une étude de 2011 qui démontre que VAMP7 et VAMP4 (seulement sous-certaines conditions) colocalisent avec les granules lytiques (Perforine+) dans les cellules NK (Krzewski 2011). Néanmoins VAMP4 est aussi impliquée dans la maturation des vésicules au niveau du réseau trans-golgien (Steegmaier 1999). VAMP4 pourrait donc intervenir dans les étapes de maturation du granule lytique, ce qui expliquerait les défauts de cytotoxicité observés. Un bon candidat en tant que R-SNARE pour la sécrétion des granules lytiques pourrait donc être VAMP2 (Matti 2013). Ceci est d’autant plus plausible qu’une interaction entre VAMP2 et STX11 a déjà été démontrée (Valdez 1999).

Dans cette même dernière étude les auteurs identifient la protéine SNAP-23 comme une Q- SNARE capable d’interagir avec STX11 et qui pourrait donc être impliquée dans la formation de ce complexe SNARE (Valdez 1999).

Autres protéines impliquées: Les protéines Rab3 et complexine qui sont connues pour réguler la sécrétion des vésicules synaptiques (vu précédemment dans la partie I de l’introduction) n’ont pour le moment pas été impliquées dans la sécrétion des granules lytiques. Néanmoins concernant les Synaptotagmines, il semblerait que la synaptotagmine-7, qui est exprimée dans les LTc après activation, puisse réguler leur cytotoxicité. En effet, l’absence de cette synaptotagmine conduirait à des défauts de cytotoxicité des LTc in vitro et in vivo mais n’influencerait pas la prolifération, la production de cytokines et la polarisation des granules

(Fowler 2007). A noter que la Synaptotagmine-7 est aussi importante pour le transport de LAT et des TCR au niveau de la synapse (Soares 2013). Il faudrait donc s’assurer que le défaut de

cytotoxicité observé ici ne soit pas dû à un défaut de signalisation du TCR mais bien à un défaut d’exocytose des granules lytiques (même s’il semblerait que la prolifération et sécrétion des cytokines ne soit pas affectée par l’absence de synaptotagmine-7)(Fowler 2007)(Figure 28).