Kinésine-1 et sécrétion mastocytaire
B- Implication de la kinésine-1 dans le transport et la sécrétion des granules de sécrétion mastocytaires:
Le processus de transport des granules de sécrétion au sein des mastocytes est peu connu, cependant il est déjà clairement établi que ce processus nécessite l’intervention de la GTPase Rab27b (Mizuno 2007) et du réseau de microtubules (Nishida 2005). Etant donné le lien moléculaire existant entre Rab27b et la kinésine-1, nous supposons que la kinésine-1 pourrait être le moteur moléculaire qui permettrait la translocation des granules jusqu’à la membrane plasmique suite à une interaction avec Rab27b initialement présent sur les granules.
Figure 53: Analyse de la capacité de différenciation des BMMC contrôles et cKOKif5b. Les BMMC contrôles et
cKOKif5b ont été marqués par les anticorps anti FcεRI et Kit
après 5 semaines de culture puis analysés par cytométrie en flux. Ces résultats sont représentatifs de 3 expériences réalisées.
1- Analyse de la capacité de sécrétion des mastocytes: Test de la libération de β-
Hexosaminidase
Afin de déterminer l’implication de la kinésine-1 dans la sécrétion des granules de sécrétion mastocytaires, le relargage de β-hexosaminidase après activation des mastocytes (Voie FcεRI) dans le surnageant a été quantifié au cours du temps par ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay). Pour cela, les BMMC contrôles et cKOkif5b ont été sensibilisés sur la nuit
avec un anticorps IgE anti-DNP puis activés par l’administration de l’allergène DNP-human serum albumin (HSA) sur des durées allant de 0,5 min à 30 min). On peut ainsi observer que la quantité de β-hexosaminidase relarguée au cours du temps est moindre dans la souris cKOkif5b comparé à
la souris contrôle. L’écart semble néanmoins s’amoindrir aux temps 10 min et 30 min, ce qui s’expliquerait par l’épuisement des BMMC contrôles qui ont fini de dégranuler (Figure 54).
2- Analyse du recrutement des granules à la membrane: microscopie confocale
Pour confirmer ces résultats, des expériences d’immunofluorescence ont été menées afin d’analyser la cinétique de recrutement des granules de sécrétion. Ainsi les BMMC contrôles et cKOkif5b ont été sensibilisés sur la nuit avec un anticorps IgE anti-DNP puis activés par
l’administration de l’allergène DNP-HSA durant 10 min ou 30 min. Pour suivre la localisation des granules au cours du temps ces derniers ont été marqués à l’aide d’un anticorps anti-STX3 (La syntaxine présente sur la membrane des granules (Guo 1998)).
En condition non stimulée, les granules sont répartis de manière homogène dans les BMMC contrôles et déficients. Cependant, 10 min après activation, alors que 80% des BMMC contrôles expriment un marquage STX3 membranaire, indiquant des évènements de translocation et de fusion des granules, seulement 15% des cellules cKOkif5b ont un marquage périphérique.
Après 30 min d’activation, la proportion de BMMC cKOkif5b qui possède un marquage STX3
périphérique augmente jusqu’à 50% mais reste néanmoins significativement plus bas que dans les BMMC contrôles. L’absence de kinésine-1 affecte donc les mastocytes dans leur capacité à transloquer et sécréter leurs granules (Figure 55).
Figure 54: Analyse du relargage de la β-hexosaminidase dans les BMMC contrôles et cKOKif5b. Les BMMC contrôles et cKOKif5b
sont sensibilisés avec les IgE anti-DNP puis activés par l’allergène DNP-HSA (20 ng/ml) sur une durée de 0,5/1/2/3/10 ou 30 min. Les résultats correspondent à la moyenne (+ SEM) de 10 expériences. Test statistique utilisé: t test (Prism).
3- Analyse du comportement des granules mastocytaires: microscopie TIRF
Le comportement de ces granules au cours du temps a été étudié par microscopie TIRF. Les évènements de translocation et de fusion qui se déroulent à la membrane plasmique peuvent ainsi être observés.
Afin de suivre les granules sécrétoires en temps réel par microscopie TIRF, il a fallu tout d’abord trouver un marqueur adéquat. Ainsi, nous avons pu constater que le marqueur wheat germ agglutinin (WGA) précédemment utilisé pour marquer les granules cytotoxiques dans les LTc
(Sepulveda 2015) constitue un bon marqueur des granules de sécrétion des mastocytes. En effet, après un marquage au WGA conjugué à l’Alexa-488 puis après une chasse de 18h, on peut constater que le marquage WGA se retrouve dans le lumen des granules marquées au STX3 (Figure 56A). De plus, nous avons pu vérifier préalablement que le marquage WGA a été internalisé de la même façon entre les deux conditions par cytométrie en flux. La même quantification du marqueur WGA est ainsi observée (Figure 56B).
Une fois le marqueur des granules sécrétoires identifié, les BMMC marqués au WGA ont été sensibilisés sur la nuit avec un anticorps IgE anti-DNP puis placés sur des lamelles coatées avec de la fibronectine. Directement après l’ajout de l’allergène, et ce durant 15 min, les cellules sont enregistrées et les évènements de transport terminal/ fusion dit de docking sont quantifiés.
Figure 55: Analyse du recrutement des granules mastocytaires dans les BMMC contrôles et cKOKif5b. (A) Les BMMC contrôles et cKOKif5b une fois adhérés aux lamelles coatées en fibronectine
sont sensibilisés avec les IgE anti-DNP puis activés par l’allergène DNP-HSA (20 ng/ml) sur une durée de 10 ou 30 min. Une condition non stimulée est aussi réalisée. Les cellules sont ensuite fixées, perméabilisées, marquées avec l’anticorps anti-STX3 puis analysées au microscope confocal. La barre d’échelle représente 2 µm. (B) Le nombre de cellules qui possédaient un marquage STX3 membranaire à ensuite été quantifié. Ces expériences ont été réalisées 3 fois et plus de 100 cellules distribuées à des endroits différents de la lamelle ont été analysées à chaque expérience. Les résultats correspondent à la moyenne (+ SEM) de 3 expériences. Test statistique utilisé: t test (Prism).
On constate que, chez le contrôle, les évènements de docking deviennent détectables à partir de 8 min et ce jusqu’à la fin de l’acquisition. Concernant les BMMC cKOKif5b, très peu
d’événements de docking sont détectés et les quelques évènements qui peuvent apparaître ne le font qu’à partir de 13 min. En l’absence de kinésine-1 nous avons donc un délai dans le processus de sécrétion des granules de sécrétion mais aussi une réduction de la quantité de granules sécrétés (Figure 56C/D), ce qui confirme les précédents résultats observés dans les expériences de relargage de β-hexosaminidase et de microscopie confocale.
La kinésine-1 semble donc être directement impliquée dans le processus de translocation et de sécrétion des granules sécrétoires au sein des mastocytes in vitro.
4- Analyse de la capacité de sécrétion des mastocytes in vivo : choc anaphylactique
Pour étudier le rôle de la kinésine-1 in vivo, des expériences de choc anaphylactique ont été réalisées sur les souris contrôles et cKOKif5b. Pour cela les souris ont été sensibilisées durant
24h avec un anticorps IgE anti-DNP puis traitées avec l’allergène DNP-HSA par des injections en
Figure 56: Analyse du comportement des granules mastocytaires dans les BMMC contrôles et cKOKif5b. (A) Les BMMC
contrôles et cKOKif5b sont marqués au WGA couplé à l’Alexa-488 puis un chasse de 18h est réalisée. Les BMMC sont ensuite
mis en contact avec les lamelles coatées en fibronectine, puis une fois adhérés les BMMC sont fixés, perméabilisés et enfin marqués avec un anticorps anti-STX3. L’analyse est réalisée au microscope confocale (B) Les BMMC contrôles et cKOKif5b
sont marqués au WGA couplé à l’Alexa-488 puis un chasse de 18h est réalisée. La quantification du marquage est réalisée par cytométrie en flux. (C) Les BMMC contrôles et cKOKif5b sont marqués au WGA couplé à l’Alexa-488 puis un chasse de 18h
est réalisée. Les BMMC sont ensuite mis en contact avec les lamelles coatées en fibronectine, puis une fois adhérés les BMMC sont ensuite sensibilisés avec les IgE anti-DNP puis activés par l’allergène DNP-HSA (20 ng/ml). Les événements de docking sont enregistrés durant 15 min après l’ajout de l’allergène au microscope TIRF. (D) Quantification des évènements de docking observés pendant les expériences de TIRF. Les résultats correspondent à la moyenne (+ SEM) de 3 expériences pour les figures A et B. 20 cellules sont analysées par conditions sur 4 expériences indépendantes pour les résultats du TIRF. Test statistique utilisé: t test (Prism). La barre d’échelle représente 2 µm.
intraveineuse. Suite à ces administrations, les mastocytes relarguent massivement le contenu de leurs granules, ce qui conduit au choc anaphylactique caractérisé par une baisse soudaine de la température. La température des souris ainsi que le relargage de MCPT-1 (Mast cell specific protease-1) dans le serum ont été monitorés afin de caractériser la sévérité du choc anaphylactique.
On peut ainsi constater que durant les phases précoces du choc anaphylactique les souris déficientes pour la kinésine-1 et les souris contrôles se comportent de la même façon. Par contre, durant les phases plus tardives du choc anaphylactique la diminution de température est moins importante dans les souris cKOKif5b comparé aux souris contrôles (Figure 57A). Concernant
le relargage de MCPT-1, on peut observer une diminution de la quantité de MCPT-1 dans le sérum des souris cKOKif5b comparé aux souris contrôles, ce qui traduit un défaut de dégranulation in vivo
(Figure 57B). Ainsi les souris déficientes en kinésine-1 sont plus résistantes aux chocs anaphylactiques.