Mécanisme d’action de l’AMPK sur la voie de signalisation de l’insuline

Pour mieux comprendre cette interaction et déterminer si l’AMPK phosphoryle et active directement l’Akt ou bien si elle agit en amont de la PI3K, nous avons utilisé un inhibiteur de la PI3K, le composé LY294002. Une courbe « dose-réponse » de cet inhibiteur a été réalisée (Figure 56). Dès 10µM de LY294002, l’insuline n’est plus capable de stimuler l’Akt (réduction de 27% vs. Contrôle). L’effet était plus important à une concentration de 50µM (réduction de 80% vs. Contrôle).

Figure 56 : Courbe « dose-réponse » de l’inhibiteur de PI3K, le composé LY294002, pour abolir l’effet stimulateur de l’insuline sur la phosphorylation de l’Akt (Ser473). La courbe « dose-réponse » (10-50-100 µM) de LY294002 (1 heure) est réalisée à partir de protéines totales de lysats cellulaires Caco-2/TC7 différenciées. Ces protéines sont soumises à un immunobuvardage de type Western à partir d’une expérience réalisée en duplicata (N=1, n=2). Les résultats sont normalisés par la quantité totale d’Akt et sont exprimés en % par rapport au contrôle. Les valeurs représentent la moyenne ±SE. *P<0,05 vs. Contrôle. ##P<0,001 vs. Insu ; ###P<0,001 vs. Insu.

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Figure 57: L’activation de l’Akt par l’AMPK est PI3K-dépendante et réciproquement, l’inhibition de la PI3K altère l’axe AMPK/ACC. Les cellules Caco-2/TC7 sont incubées simultanément avec un inhibiteur de la PI3K, le LY294002 (LY) (50µM, 1h) et un activateur de l’AMPK, l’AICAR (8mM, 3h). Puis elles sont stimulées par l’insuline (60mUI/ml, 15min). Niveaux de phosphorylations de l’AKT (Ser473) en présence de LY seul ou LY+AICAR (A), de l’AMPK (Thr172) en présence de LY seul ou LY+AICAR (B), de l’ACC (Ser79) en présence de LY seul ou LY+AICAR (C). Les protéines totales issues de lysats cellulaires sont examinées par immunobuvardage de type Western. Les résultats obtenus sont normalisés par la quantité totale de β-actine ou de la protéine d’intérêt lors de 3

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expériences distinctes réalisées en triplicatas (N=3, n=9). Les valeurs représentent la moyenne ±SE et sont exprimées en % du contrôle. **P<0,01 vs. Contrôle ; ***P<0,001 vs. Contrôle.

D’après les graphiques A, B et C de la Figure 57, les conditions expérimentales étaient validées puisque l’insuline phosphoryle l’Akt (1,6 fois) mais pas en présence de l’inhibiteur de PI3K (LY294002); et puisque l’AICAR favorisait la phosphorylation de l’axe AMPK/ACC. En outre, les résultats illustrés dans la Figure 57A confirment que l’activation de l’AMPK par l’AICAR stimule l’Akt. D’autre part, le graphique A indique que l’inhibition de la PI3K par LY294002 ne permettait plus à l’AMPK de phosphoryler l’Akt. Ainsi, l’AMPK stimule l’Akt en activant une kinase en amont de la PI3K ou elle-même. Le mécanisme d’action est donc similaire à celui de l’insuline puisque la phosphorylation de l’Akt est PI3K-dépendante.

Curieusement, l’inhibition de la PI3K altérait la phosphorylation de l’AMPK (Figure 57B). De même, l’inhibition de la PI3K ne permettait plus la phosphorylation de l’AMPK par l’AICAR. Ces résultats témoignent d’une réciprocité entre les deux voies de signalisation AMPK/insuline. Cela impliquerait que soit la PI3K a un effet direct sur l’AMPK, soit la PI3K inhibe une phosphatase qui régule négativement la phosphorylation de l’AMPK, soit elle régule positivement une des kinases en amont de l’AMPK (LKB1, CaMKKβ, TAK1). Par ailleurs, les résultats de la Figure 57B et C, montrent que l’inhibition de la PI3K altère l’axe AMPK/ACC impliqué dans la lipogenèse, puisque l’AICAR n’est plus capable d’augmenter la phosphorylation de l’ACC de manière AMPK-dépendante.

Ces résultats indiquent que la PI3K joue un rôle dans la régulation de l’AMPK. Il existe donc une réciprocité entre les deux voies de signalisation AMPK/insuline. L’activation de l’AMPK favorise l’activation de l’Akt. Au contraire, l’inhibition de la voie PI3K/Akt entraîne l’inhibition de l’axe AMPK/ACC.

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Absorption intestinale du glucose :

Puisque l’AMPK, lorsqu’elle est active, est capable de stimuler la voie de signalisation de l’insuline (Ser473 phospho-Akt), nous avons étudié son effet sur l’absorption intestinale du glucose. Il est à noter que le rôle de l’insuline dans la régulation de l’absorption intestinale du glucose est sujet à des controverses dans la littérature. En effet, certains auteurs ont montré que l’insuline inhibe l’absorption intestinale du glucose (Tobin et al., 2008) alors que d’autres ont montré le contraire (Serhan et Kreydiyyeh, 2010). Cette étude avait donc pour objectif de clarifier le rôle de l’insuline dans l’absorption entérocytaire du glucose et bien entendu de montrer l’implication de l’AMPK dans cette régulation.

Figure 58: L’insuline et l’AICAR inhibent l’absorption entérocytaire du glucose par un mécanisme PI3K et AMPK-dépendant respectivement. Les cellules Caco-2/TC7 sont incubées pendant 1 heure avec le composé LY294002 (50µM) et/ou pendant 3 heures avec l’AICAR (8mM). La capture du glucose est mesurée par l’incorporation de [3_{H]-2-désoxy-glucose. Les valeurs représentent la moyenne}

±SE obtenues à partir de 3 expériences réalisées en duplicatas (N=3, n=6). Les résultats sont exprimés en % du contrôle. *P<0,05 ; **P<0,01 ; ***P<0,001.

Comme il a été montré dans la Figure 58, l’insuline inhibait de 40% l’absorption du glucose par les cellules intestinales Caco-2. Ce résultat confirme les travaux de Tobin & Brot- Laroche (Tobin et al., 2008). Par ailleurs, l’effet de l’insuline était PI3K-dépendant puisque l’inhibition de la PI3K par LY294002 ne permettait plus la réduction de l’absorption du glucose mais avait tendance à l’augmenter (25%). En outre, l’activation de l’AMPK par

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l’AICAR produisait le même effet que l’insuline, c'est-à-dire une diminution de l’absorption du glucose de 52%. L’inhibition de PI3K abolissait l’effet de l’AICAR en favorisant plutôt l’absorption du glucose de 60%.

D’après les résultats, l’action de l’insuline sur l’absorption intestinale du glucose est « entéro-spécifique ». Alors que dans le muscle squelettique ou le tissu adipeux l’insuline induit l’entrée du glucose, son rôle au niveau des entérocytes serait de limiter l’absorption du glucose. Ce mécanisme est PI3K-dépendant. D’autre part, l’activation de l’AMPK permet également de réduire l’absorption du glucose par un mécanisme PI3K-dépendant. Ces données semblent indiquer que l’AMPK phosphorylerait et activerait l’AKT en empruntant la même voie que l’insuline. Elle jouerait donc un rôle dans l’amélioration de l’homéostasie glucidique en stimulant la voie de signalisation de l’insuline.