Localisation membranaire de Rv3269 et CtpC

La séquence en acides aminés de Rv3269 contient un domaine transmembranaire potentiel dans la partie N-terminale (Figure 29), aussi nous avons voulu confirmer la localisation membranaire de cette protéine.

N a d ab d c i a ag e di ig e, e a ide pGMCS-PRv3269

-Rv3269Flag-ctpCHis, un variant de pGMCS-PRv3269-Rv3269-ctpC. Ce plasmide exprime Rv3269Flag, une forme de Rv3269 portant une étiquette Flag (Asp-Tyr-Arg-Asp-Asp-Asp-Asp-Arg) insérée en C-terminal. Il exprime aussi CtpCHis, a 6 hi idi e aj e e i C-terminale de CtpC.

En parallèle, nous avons inséré sur pGMCS-PRv3269-Rv3269-ctpC la séquence codant la protéine reportrice fluoresçant en bleu mTurquoise2, générant une fusion Rv3269-mTurquoise2 (Rv3269mT), da a e e a i e f e ce e e a ach e e i C-terminale de Rv3269 par un linker (Leu-Glu-Gly-Ser-Gly). De même, nous avons construit une fusion CtpC-mVenus (CtpCmV), exprimant une protéine reportrice fluoresçant en jaune (construction schématisée sur la Figure 32B).

Les souches de M. smegmatis 2 transformées par les plasmides pGMCS-PRv3269

-Rv3269-ctpC et pGMCS-PRv3269-Rv3269Flag-ctpCHis ont été cultivées et les culots de cellules obtenus i f ac i e e , a a e f ac i di e d e e e (cell wall, cw), une fraction dite de membrane (mb) et une fraction contenant les protéines cytoplasmiques solubles (cyt) (Lucas et al., 2015). Les protéines des différentes fractions ont été analysées par western-b e i i a a ic di ig i c e i e e F ag i c e i e e His6. Comme attendu, la protéine CtpCHis (masse moléculaire théorique de 77,3 kDa) a été trouvée essentiellement dans la fraction membranaire « mb », validant le protocole de fractionnement utilisé. Pour sa part, la protéine Rv3269Flag (10,8 kDa) donne un signal fort dans la fraction membrane, mais aussi dans la fraction « cw » (Figure 32A panneau de gauche).

Les cellules de la souche 2 transformées par les plasmides pGMCS-PRv3269-Rv3269mT-ctpCmV

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analysées par western-b . L h b ida i a ec a ic a i-GFP, révélant à la fois la mTurquoise2 et la mVenus, confirme les résultats des fractionnements précédents. CtpCmV

(103,7 kDa) est essentiellement trouvée dans la fraction mb alors que Rv3269mT (36,9 kDa) est retrouvée dans la fraction mb et aussi dans la fraction cw (Figure 32A panneau de droite). D a e a , e a ide pGMCS-PRv3269-Rv3269mT-ctpCmV a été introduit dans la souche H37Rv (Rv3269-ctpC)::zeoR de Mtb et les cellules de la souche transformée ont été inactivées par un agent fixateur (PFA) et observées en microscopie à fluorescence. Ces observations ont montré que CtpCmV et Rv3269mT forment toutes les deux des patchs de fluorescence au niveau des membranes (Figure 32B). L a a e de i age b e e a montré que les patchs de CtpCmV et ceux de Rv3269mT co-localisent. La co-localisation peut être visualisée grâce aux spectres des fluorescences bleu et jaune tracés sur les cellules individuelles sur les images de microscopie. De plus, la superposition a été quantifiée par le calcul via e gi JAC P (I age J) d c efficient de Pearson (r ; en rouge) mesurant la e i i de i e da e b e e e ja e e e b e d e i age. Ce c efficie varie entre une valeur de 1 pour une co-localisation parfaite entre deux pixels et 0 pour une absence totale de co-localisation. Il a une valeur moyenne de 0,95 ou 0,96 pour les images montrées Figure 32B.

Le plasmide pGMCS-PRv3269-Rv3269mT-ctpCmV a aussi été introduit dans la souche de

M. smegmatis mc2155 2 et les observations en microscopie à fluorescence sur les cellules fixées à la PFA ont donné des résultats équivalents à ceux obtenus avec Mtb (résultats non montrés). La mesure de la co-localisation par calcul du coefficient de Pearson a été automatisée grâce à une macro-commande développée par Brice Ronsin, de la plateforme de

ic c ie d Ce e de Bi gie I g a i e (CBI), T e, e e a d a a e grand nombre de cellules sur les clichés de microscopie. Le coefficient de Pearson moyen obtenu sur 413 cellules individuelles est de 0,80 (Figure 32C), confirmant la co-localisation et gg a e e de i e R 3269 e C C ag ge da de c e e i-protéiques communs.

L i i a i de M. smegmatis mc2155 2 a a i e i d b e e e ic c ie fluorescence des cellules non fixées. Avec ces cellules vivantes, nous avons observé que les patchs de Rv3269mT et de CtpCmV sont dynamiques. En effet, des prises de vue en time-lapse, toutes les 200 ms ont permis de réaliser des vidéos montrant le déplacement des patchs entre chaque image. Les deux types de patch ont ce comportement. La dynamique de ces patchs

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Figure 33. Quantification des patchs de Rv3269mT.

A. Production de Rv3269mT sous le contrôle des promoteurs PRv3269 sauvage ou Psub.. Les extraits totaux non-lysés (NL) ou fractionnés sont analysés par western-blots avec un anticorps anti-eGFP.

B. Observation en microscopie à fluorescence de cellules M. smegmatis 2 exprimant

Rv3269mT sous le contrôle du promoteur sauvage (PRv3269) ou muté (Psub.).

C. Distribution des nombres moyens de patchs Rv3269mT b e a a a e de 173 bactéries de la souche M. smegmatis 2 portant le plasmide pGMCS-Psub.-Rv3269mT-ctpC.

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e a ide e i i i e a ch d d e i age a i a e, ce qui ne nous a pas permis de mesurer des trajectoires ou des vitesses de déplacement. La détection de Rv3269mT a également dévoilé des patchs très intenses et immobiles aux

e . L i e i de a f e ce ce i e a ce a ch e e e e f e e, da beaucoup de cellules, les réglages de prise de vue en microscopie rendent difficile la détection des autres zones fluorescentes, pouvant masquer les patchs sur les membranes (Figure 33B). N a fai h h e e ce a ch i e e e i bi e aie c e d e de c d i c i , c e -à-di e de ag ga de i e e e c , i a aie a atteindre leur localisation membranaire physiologique. Afin de résoudre ce problème, nous avons muté le promoteur PRv3269 da i e de di i e e e i , e de d i e a quantité de protéines en excès. PRv3269 sauvage présente une région -10 étendue, de séquence TGTTAATGT (nucléotides consensus en gras). Nous avons modifié cette séquence en CCTTAATGT, afi d i d i e e a i down-promoter. Une analyse en western-blot a d ab d c fi e a b i i i d i e, g a e a ia d e a e Psub., diminue significativement la production de Rv3269mT, avec une baisse de la proportion de la protéine retrouvée dans la fraction cw (Figure 33A). M e i e a e a a preuve définitive, ces résultats suggèrent que la production de Rv3269mT sous le contrôle du promoteur natif PRv3269 génère des agrégats polaires de protéines, qui se retrouvent dans le culot de centrifugation définissant la fraction cw. Ainsi, la détection de Rv3269 dans cette fraction pourrait être un artéfact, mais des expériences supplémentaires sont nécessaires pour c fi e ce e h h e. E i e, b e a i e ic c ie f e ce ce a e forte atténuation des spots polaires, révélant beaucoup mieux les spots bleus répartis sur la membrane (Figure 33B). L ab i i de spots polaires nous a alors permis de quantifier le nombre moyen de patchs par bactérie. Pour prendre en compte la dynamique des protéines au sein de la bactérie, 13 clichés ont été enregistrés à différents temps (toutes les 10 sec) et le nombre de patchs a été déterminé sur chacun des clichés. Le nombre moyen de patchs sur les 13 clichés a été calculé pour 173 cellules bactériennes. La distribution est centrée sur un nombre moyen de 7 patchs de Rv3269mT par bactérie (Figure 33C).