Localisation génomique et conservation du

T4SS chez Wolbachia.

La détermination complète de la séquence du T4SS de wVulC nous a permis dans une seconde publication de prospecter de manière extensive l’histoire évolutive du T4SS chez Wolbachia [cf. Article 2 : (Pichon et al. 2009), p. 35]. L’alignement de chaque gène composant le T4SS a été réalisé en intégrant les séquences disponibles dans GenBank. Nous avons ainsi déterminé des couples d’amorces consensuelles pour amplifier par PCR l’intégralité des opérons et déterminer l’organisation des gènes du T4SS chez 27 souches de Wolbachia. Cette étude a été réalisée chez 18 espèces d’isopodes terrestres appartenant à sept des huit familles connues pour héberger Wolbachia (Tableau S1, p. 36). L’analyse a été également étendue à 9 autres souches de Wolbachia infectant des insectes et des araignées (Tableau S1, p. 36).

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Figure 11: Phylogénie des Rickettsiales.

Arbre phylogénétique des Rickettsiales (39 souches) généré par Neighbor-Joining (distance) avec Mega4 à partir de l’alignement des séquences protéiques concaténées de cinq constituants du T4SS (VirB3,-B4,-B8,-B9,-B11). Les valeurs de bootstrap obtenues (1000 replicats) sont indiquées au niveau des nœuds au dessus de chaque branche. Les supergroupes ou clades de Wolbachia sont également indiqués.

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Les résultats ont montré que les gènes du T4SS sont présents dans l’ensemble des souches de Wolbachia étudiées dans ce projet, quelque soit le phénotype induit (Fig. 1, Article 2). L’analyse des séquences indique que virB3 et virB11, comme tous les autres gènes du T4SS sont des gènes extrêmement conservés au sein des Wolbachia et soumis à une sélection conservatrice (Table 1, Article 2). Ainsi, les pressions de sélection s’exerçant sur ce système de sécrétion restreignent la variabilité de séquences à l’échelle nucléique et donc limitent les changements de conformation des protéines. Ce résultat suggère le rôle majeur du T4SS dans la physiologie de Wolbachia. Cette notion prend d’autant plus de poids lorsque l’on sait que le génome de ces bactéries symbiotiques est soumis à des recombinaisons. Les opérons du T4SS représentent donc des portions de génomes d’au minimum 10 kb dont la structure et les séquences ont été fortement conservées depuis la divergence des Rickettsiales. A ce propos, la phylogénie réalisée avec les protéines les mieux conservées du T4SS (VirB3,-B4,-B8,-9 et –B11) révèle une topologie similaire à celle obtenue avec d’autres marqueurs (Figure 11).

Si le nombre, l’ordre et la taille des gènes composant les opérons du T4SS sont conservés chez Wolbachia, les régions flanquantes en 5’ et 3’ de l’opéron virB8-D4 sont variables (Fig. 1 et 2, Article 2). En effet, l'analyse des régions situées en aval de l'opéron virB8-D4 comprend la première caractérisation de séquences d’insertion (IS) dans le génome de wVulC (Fig. 1 et 2, Article 2). Bien que réduits, les génomes de Wolbachia sont connus pour être exceptionnellement riches en éléments transposables qui sont tenus pour responsables de réarrangements occasionnés tout au long du génome notamment dans la région en 3’ de virD4 (Sanogo et al. 2007). Ce travail m’a aussi permis de mettre à profit le large spectre de souches de Wolbachia pour aider à caractériser une famille d’IS, ISWpi1, spécifique et très répandue dans les génomes de Wolbachia [cf. Article 3 : (Cordaux et al. 2008), p. 38]. Cette étude a montré que ces génomes sont soumis à des épisodes récurrents de prolifération et de pertes de séquences d’insertion (Fig. 1, Article 3).

De façon intéressante, certains gènes du T4SS sont dupliqués dans le génome de Wolbachia. Les génomes publiés de Wolbachia ont révélé l’existence des paralogues des gènes virB4, virB6, virB8 et virB9 (Wu et al. 2004, Foster et al. 2005, Klasson et al. 2008, Klasson et al. 2009) (Figure 12). Bien que détectés dans les contigs issus du séquençage de wVulC (Figure 12), les analyses par Southern Blot (Félix 2004) n’avaient pas permis d’identifier ces paralogues certainement à cause de leur faible pourcentage d’identité (34 à 57%). De plus, trois gènes virB6 suivent directement en 3’ le premier gène virB6 de l’opéron virB3-B6 (Fig. 2, Article 2). Nous ne savons pas encore si ces trois paralogues de virB6 sont cotranscrits chez wVulC avec les autres gènes de l’opéron virB3-B6 comme cela a été montré dans d’autres modèles (Ohashi et al. 2002, Wu et al. 2004, Rancès et al. 2008).

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Figure 12: Cartographie génomique des gènes vir de Wolbachia.

A l’aide du logiciel pDRAW 3.2 (www.acaclone.com), sont représentées les localisations génomiques des opérons

vir (virB3-B6 en bleu et virB8-D4 en rouge) ainsi que celles des paralogues des gènes virB4-2 (vert), virB8-2 (orange) et virB9-2 (violet). Les régions vir identifiées chez wVulC sont représentées sous forme de contigs linéaires et sont déssinés à

l’échelle. La localisation génomique de cinq gènes marqueurs (fbpA, hcpA, coxA, gatB et ftsZ) pour les quatre génomes publiés (wMel, wBm, wPip-Pel et wRi) est également indiquée. La base 1 des génomes circulaires est arbitrairement la première base du gène fbpA.

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Cependant, les alignements que j'ai réalisés indiquent que les 4 paralogues de virB6 sont ni alignables entre eux au sein d’une même souche de Wolbachia ni avec aucun virB6 d’autres Rickettsiales. Néanmoins ces gènes ont été identifiés comme des paralogues de virB6 car ils codaient des protéines possèdant toutes un domaine TrbL caractéristique et étaient capables de s’enchâsser dans la membrane interne d’après les analyses de prédiction de localisation cellulaire. Une analyse plus poussée permettrait de déterminer si ces paralogues jouent un rôle dans la formation du T4SS des α-protéobactéries en augmentant la variabilité des constituants du pore ou bien s’ils ne sont que le produit de recombinaisons ou transpositions.

Différents mécanismes peuvent néanmoins être avancés quant à la présence de paralogues de gènes du T4SS :

· La sélection sur ces gènes est neutre et leur maintien dans le génome n’engendre aucune conséquence pour la bactérie.

· Les gènes sont maintenus par conversion génique comme cela a été supposé chez Anaplasma spp. (Palmer et Brayton 2007, Noh et al. 2008). Les produits de gènes sont alors interchangeables entre eux et ce grâce à la conservation de leur structure et de leur fonction (Seubert et al. 2003, de Paz et al. 2005).

· La divergence des gènes a permis de créer de nouveaux rôles utiles par exemple pour l’adaptabilité à de nouveaux hôtes ou conjointement à la nature des effecteurs sécrétés. Des études récentes montrent également dans le genre Ehrlichia l’implication des quatre paralogues de VirB6 dans la formation d’un complexe avec VirB9 et des protéines de la vacuole contenant la bactérie (Niu et al. 2006, Bao et al. 2009).

Notre approche de mesure des pressions de sélection sur les gènes du T4SS n’a pas permis de mettre en évidence une diversification des séquences au sein de différentes souches de Wolbachia. Au contraire, les paralogues sont soumis à des pressions de conservation tout comme les autres gènes du T4SS. Aucune marque de sélection positive n’a pu être mise en évidence sur les régions flanquantes des opérons. Tout cela suggère que les réarrangements génomiques autour des opérons sont certainement anciens et indépendants de la nature des régions flanquantes des opérons du T4SS chez Wolbachia.

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