CHAPITRE 2: MATERIEL ET METHODES
B- Immunodétection de type western
3.3. Lignées non-épithéliales
Avec les lignées non-épithéliales d'un mélanome, EFFRON, (figure 16) et les fibroblastes humains normaux, aucune bande de protéine n'est reconnue par 1'anticorps monoclonal, 1B6, figure 17. Une faible bande sur la lignée U-251 (astrocytome) un peu en-dessous de 66 kd dans l'échantillon de protéines insolubles au Triton X-100 est aussi présente avec un témoin négatif, un autre anticorps monoclonal, de la même classe, mais spécifique à une protéine de 35 kD chez le rat; elle est donc probablement un artéfact.
3.4. Lignées épithéliales
D'après les immunodétections faites sur les lignées épithéliales, 1B6 réagit avec au moins 5 cytokératines. Il n'y a qu'une seule des lignées utilisées dont la composition en cytokératines est décrite (Moll et coll., 1982). Les MCF-7 ont 3 cytokératines: 40, 45 et 52 kD. Par immunodétection, on remarque que 1B6 reconnaît les 3 cytokératines: #8, 18 et 19 selon la nomenclature donnée par Moll et coll. (1982), figure 18.
Dans le cas de la lignée ME-180 (carcinome épidermoïde du col utérin), 1B6 réagit avec des cytokératines dont le poids moléculaire relatif est de 52.5 et 48 kD (# et 16),figure 19.
Dans un échantillon de protéines totales de peau humain, on détecte une bande à 65-67 kD et une à 56 kD. 1B6 ne réagit qu'avec celle de 56 kD, figure 20.
L'immunodétection a été fait sur d'autres lignées épithéliales. Il semble que 186 reconnaisse d'autres cytokératines, car il est possible d'observer des bandes à 50 kD (DU 145) et 54 ou 56 KD (ROAC), entre autres, en sa présence. La composition complète en cytokératines de ces lignées n'est pas connue, mais il est certain qu'il y a au moins 2 cytokératines dans chacune des lignées puisqu'il est nécessaire d'avoir au moins une paire de cytokératines pour former les fibres de filaments intermédiaires. Donc,
FIGURE 16: Immunodetection de type western sur la lignée EFFRON. Les protéines des filaments sont enrichies au Triton X-100. 1B6 ne reconnaît aucune protéine. a: Bleu de Coomassie, b: autoradiographie. (s: protéines standards ; e : échantillon enrichi ; t: protéines totales de l'échantillon.)
FIGURE 17: Immunodétection de type western sur les fibroblastes humains normaux. Aucune bande n'est détectée par 186. a: Bleu de Coomassie, b: autoradiographie, (s: protéines standards; e: échantillon enrichi; t: protéines totales de l'échantillon. )
FIGURE 18: Immunodétection de type western sur les protéines de filaments intermédiaires enrichies par le Triton X-100 et les protéines totales de la lignée MCF-7. a: gel SDS-PAGE, bleu de Coomassie; b: transfert sur nitrocellulose, coloration au rouge Ponceau; c: autoradiographie. 1B6 reconnaît les 3 protéines correspondant aux cytokératines. (s: protéines standards ; e: échantillon enrichi ; t: protéines totales de l'échantillon.)
A B
SET E
FIGURE 19: Immunodétection de type western sur les protéines des filaments intermédiaires enrichies par le Triton X-100 et sur des protéines totales de la lignée ME-180. 186 réagit avec 2 des 4 bandes présentes dans le puits contenant les protéines insolubles au Triton X-100. Ces bandes ont un poids moléculaire de 48 et 52.5 kD. Celles avec lesquelles il ne réagit pas correspondent à la vimentine (58 kD) et à l'actine (43 kD). a: Bleu de coomassie, b: autoradiographie. (s: protéines standards; e: échantillon enrichi ; t: protéines totales de l'échantillon.)
FIGURE 20: Immunodétection de type western avec un échantillon de protéines totales de peau humaine. Deux bandes sont présentes dans cet échantillon (65 et 56.5 kD) et 186 ne réagit qu'avec celle de 56.5 kD. a: Bleu de Coomassie, b: autoradiographie. (s: protéines standards; e: échantillon enrichi ; t: protéines totales de 11 échantillon.)
si dans les cellules DU-145 la cytokératine de 50 kD est présente, il y a probablement celle de 58 kD aussi. Chez la lignée ROAC, en plus de la 54 kD,il y aura la 46 kD. De plus, il peut y avoir les cytokératines susceptibles d'être dans les cellules d'origine épithéliale simple pour la lignée ROAC et celles présentes chez les cellules d'origine épithéliale squameuse pour la lignée DU-145. La réaction n'a pas été faite avec la lignée SW-780, mais en comparant la réaction d'immunofluorescence de 1B6 et de l'anti-cytokératine #18 (fig. 10) sur cette lignée, il est fort probable que 1B6 reconnaisse plus d'une cytokératine (#18). D'ailleurs, la reconnaissance de cette cytokératine a été constatée par immunodétection de type western sur la lignée MCF-7.
4- DISCUSSION ET CONCLUSIONS
L'approche des anticorps monoclonaux a permis d1 obtenir un anticorps monoclonal reconnaissant des molécules présentes dans les cellules épithéliales, souvent sous forme de filaments.
La caractérisation de cet anticorps par différentes méthodes nous a permis de déduire que ces fibres appartiennent à la famille des filaments intermédiaires : les cytokératines.
Lorsque testé avec des coupes de tissus épithéliaux humains, 186 réagit avec tous les épithéliums de type simple, transitionnel, squameux ou kératinisé. Sur des tissus non-épithéliaux, notre anticorps monoclonal ne réagit pas. Ces résultats nous laissent croire qu'il reconnaît un déterminant antigénique spécifique aux cellules épithéliales. Avec les testicules, la réaction n'est pas très forte. Dans ce tissu, contrairement aux autres tissus épithéliaux, il y a coexpression de la vimentine avec les cytokératines (Ramaekers et coll., 1982) due probablement au recouvrement par les tissus fibreux, de l'épithélium stratifié modifié (Leeson et Leeson, 1976). De même, les canaux séminifères des testicules ne contiennent aucune cytokératine. Donc, si la coupe sur laquelle la réaction a été faite était en majorité de canaux séminifères, il est normal que 1'intensité soit faible.
Il semble donc que 186 réagit avec tous les types de tissus épithéliaux normaux et tumoraux testés et ceci pour plusieurs individus différents. D'autre part, il ne semble pas réagir avec des tissus d'origine non-épithéliale. Dû à la très grande intensité de sa coloration, à son activité même sur des tissus paraffinés, ainsi qu'à son unique patron de réactivité, cet anticorps pourrait s'avérer un outil très utile et efficace pour le diagnostic en pathologie. De plus, il n'y a à notre connaissance aucun réactif commercial équivalent.
Avec les lignées cellulaires où les cellules sont très étalées, nous nous rendons compte que l'épitope reconnu par 1'anticorps monoclonal est présent sur des protéines en général fibrillaires ayant la morphologie des filaments de la famille des filaments intermédiaires. Vraisemblablement, ces filaments correspondraient à des cytokératines puisque 186 ne semble reconnaître que les cellules épithéliales et qu'il n'y a pas d'autres protéines caractérisées propres au tissu épithélial. Toutes les lignées
épithéliales analysées sont tumorales impliquant la possibilité que les lignées provenant des différents tissus tumoraux aient moins de cytokératines que les tissus d'origine et de plus, sauf quelques rares exceptions, elles contiennent toutes de la vimentine, (Traub, 1985). Cet état pourrait expliquer pourquoi avec certaines lignées (RUPP II), 1 ' intensité est très faible. Il se pourrait aussi, qu'après plusieurs passages, la lignée se soit transformée et de ce fait, ait perdu la capacité d'exprimer les cytokératines ou, du moins que l'expression soit diminuée (Traub, 1985).
Nous notons aussi que 186 réagit essentiellement avec toutes les lignées épithéliales, qu'elles proviennent d'un carcinome ou d'un adénocarcinome.
On remarque qu'avec certaines lignées épithéliales, MCF-7, ROAC, SW-780 et DU 145, 1'intensité varie d'une cellule à l'autre. Une cause possible peut être le masquage d'épitope sur certaines cytokératines (Franks et coll., 1983a) dépendant du stade du cycle cellulaire dans lequel les cellules se trouvent. La diminution de 1'expression des cytokératines peut aussi en être la cause. Si nous étudions ces 4 lignées, nous constatons que 3 d'entre elles proviennent de tissus hormono-dépendants (glandes mammaires, ovaire et prostate). D'ailleurs, une étude a déjà été faite à ce sujet et les auteurs ont constaté qu'il y avait induction de 1'expression du gène de certaines cytokératines par différentes hormones, l'estrogène entre autres, qui s'effectue à un niveau post-transcriptionnel (Steinert et coll., 1985). Peut-être certaines cellules contiennent-elles plus d'hormones que d'autres ce qui pourrait expliquer la différence d'intensité observée. C'est une avenue qui pourrait être plus exploitée.
Nous pourrions penser à un masquage du déterminant antigénique des cytokératines dans la lignée 5K-LC-6 puisque la réactivité avec 186 n'est pas très intense et est même douteuse. Il se pourrait que cette lignée dite d'origine épithéliale soit, en réalité, d'une provenance autre qu'épithéliale, (Richard Cote, New-York, communication personnelle). D'ailleurs, lorsque nous effectuons une réaction d'immunofluorescence avec un anticorps monoclonal anti-vimentine, nous notons une très forte réaction au niveau des filaments, suggérant une origine mésenchymateuse de cette lignée (voir fig. 13).
Si nous observons une certaine réaction sur les cellules de la lignée U-251, c'est peut-être, comme l'ont constaté Gould et coll. (1986), dû à la
présence de membres de la famille des filaments intermédiaires dans un tissu tumoral autre que celui qu'il caractérise normalement. Par contre, même s'il y a réaction, nous n'observons aucun filament. Nous ne pouvons pas, cependant, nous fier entièrement aux cellules en culture pour poser un diagnostic sur le type de cellules et de tumeurs dû à la présence de vimentine et de cytokératines (Ramaekers et coll., 1982).
Lorsque nous effectuons une immunodétection de type western, cela nous permet de connaître combien de protéines 1'anticorps reconnaît et leur poids moléculaire relatif. Au cours de ce travail, nous avons constaté que 1B6 en reconnaît au moins 5 et qu'elles font partie de la famille des cytokératines par leur présence dans les échantillons de protéines des cellules épithéliales insolubles au Triton. Dans certains cas, il est difficile de connaître le poids moléculaire exact de la protéine avec laquelle 1'anticorps réagit dû à une très grande proximité des poids moléculaires des protéines des filaments intermédiaires. Cet inconvénient est amplifié car les protéines des filaments intermédiaires présentes dans chaque lignée ne sont pas connues avec précision. On doit se référer aux cytokératines présentes dans les tissus normaux ou d'une façon plus générale, en tenant compte du type d'épithélium seulement (simple, stratifié, etc.). Pour identifier convenablement les cytokératines présentes, il serait préférable d'effectuer une électrophorèse en 2 dimensions avec ces échantillons. Par contre, le poids moléculaire relatif des 5 protéines correspond au poids moléculaire des cytokératines déjà admis dans la littérature.
D'une façon générale, si nous comparons notre anticorps monoclonal 186 avec certains anticorps monoclonaux décrits dans la littérature, 186 s'avère être un bon outil de détection des cellules épithéliales. Premièrement, il reconnaît plusieurs cytokératines et contrairement à certains anticorps (Cooper et coll., 1985; Nelson et Sun, 1983; Nelson et coll., 1984), il n'est pas limité aux cytokératines du type I ou à celles du type II ce qui nous laisse croire que 1'épitope reconnu se trouve dans le domaine central de la chaîne peptidique des cytokératines. Mais, puisque seulement les cytokératines sont reconnues, cet épitope doit être absent des autres filaments intermédiaires. Ces résultats suggèrent la possibilité que 186 réagisse aussi avec d'autres cytokératines. Un autre anticorps monoclonal ne fait pas de différence entre les 2 types, mais il ne reconnaît que 2 cytokératines (Knight et coll., 1985). Comme cet épitope n'est pas détruit
par la dénaturation des protéines dans le SDS, il est très probable qu'il soit linéaire, i.e. dépendant de la séquence d'acides aminés. Il serait donc intéressant de rechercher dans une banque de séquences de protéines ou de gènes une brève séquence ayant les propriétés décrites plus haut: localisée dans la partie centrale, commune à plusieurs, sinon toutes les cytokératines et absente chez les autres filaments intermédiaires.
En conclusion, les résultats présentés dans ce mémoire démontrent qu'un anticorps monoclonal, 1B6, choisi dans une banque d'anticorps réagissant avec les cellules épithéliales, réagit avec un grand nombre de cytokératines et probablement uniquement avec les cytokératines. Comme il a présenté sur les coupes de tissus une fréquence de faux positifs ou de faux négatifs à peu près nulle, il semble qu'il serait un outil utile, et pour le moment unique, pour le diagnostic en pathologie. Comme il a mis en évidence des patrons de réactivité différents avec diverses lignées cellulaires, selon leur origine plus ou moins maligne ou selon leur activité métabolique, il pourrait aussi être un outil intéressant en recherche fondamentale pour étudier la différenciation des cellules épithéliales, la nature de la malignité des tumeurs et le rôle biologique des cytokératines.
BIBLIOGRAPHIE
Berner, P.F., E. Frank, H. Holtzer et A.P. Somlyo. The intermediate filament proteins of vascular smooth muscle : immunofluorescent studies of desmin and vimentin. J. Muscle Res. Cell Motil.,
2i
439-452, 1981. Bolton, A.E.. dans: Radioiodination techniques, Radiochemical CentreAmersham, England, p. 45, 1977.
Broers, J., A. Huysmans, 0. Moesker, P. Ramaekers et S. Wagenaar. Small cell lung cancers contain intermediate filaments of the cytokeratin type. Lab. Invest., 52: 1, 113-115, 1985.
Caselitz, J., J. Becker, G. Seifert, K. Weber et M. Osborn. Coexpression of keratin and vimentin filaments in adenoid cystic carcinomas of salivary glands. Virchows Arch. Pathol. Anat., 403: 337-344, 1984. Cooper, D., A. Schermer et T-T. Sun. Biology of disease. Classification of
human epithelia and their neoplasms using monoclonal antibodies to keratins : strategies, applications, and limitations. Lab. Invest., 52: 3, 243-256, 1985.
Debus, E., K. Weber et M. Osborn. Monoclonal cytokeratin antibodies that distinguish simple from stratified squamous epithelia: characterization on human tissues. EMBO J., 1_: 12, 1641-1647, 1982. Debus, E., R. Moll, W.W. Franks et M. Osborn. Immunohistochemical
distinction of human carcinomas by cytokeratin typing with monoclonal antibodies. Am. J. Pathol., 114: 121-130, 1984.
Foster, C.S., P.A.W. Edwards, E.A. Dinsdale et A.M. Neville. Monoclonal antibodies to the human mammary gland. I- Distribution of determinants in non-neoplastic mammary and extra mammary tissues. Virchows Arch. Pathol. Anat., 394: 279-293, 1982a.
Foster, C.S., E.A. Dinsdale, P.A.W. Edwards et A.M. Neville. Monoclonal antibodies to the human mammary gland. II- Distribution of determinants in breast carcinomas. Virchows Arch. Pathol. Anat., 394: 295-305, 1982b.
Franks, W.W., K. Weber, M. Osborn, E. Schmid et C. Freudenstein. Antibody to prekeratin: decoration of tonofilament-like arrays in various cells of epithelial character. Exp. Cell Res., 116: 429-445, 1978.
Franks, W.W., D.L. Schiller, R. Moll, S. Winter, E. Schmid et I. Engelbrecht. Diversity of cytokeratins: Differentiation specific
expression of cytokeratin polypeptides in epithelial cells and tissues. J. Mol. Biol., 153; 933-959, 1981a.
Franks, W.W., D. Mayer, E. Schmid, H. Denk et E. Borenfreund. Differences of expression of cytoskeletal proteins in cultured rat hépatocytes and hepatoma cells. Exp. Cell Res., 134: 345-365, 1981b.
Franks, W.W., E. Schmid, J. Wellsteed, C. Grund, 0. Gigi et B. Geiger. Change of cytokeratin filament organization during the cell cycle : Selective masking of an immunologic determinant in interphase PtKg cells. J. Cell Biol., 97: 1255-1260, 1983a.
Franks, W.W., E. Schmid et R. Moll. The intermediate filament cytoskeleton in tissues and in cultured cells: differentiation specificity of expression of cell architectural elements. Dans : Harris CC., Autrup HN
(eds) Human carcinogenesis, Academic Press, Orlando, pp 3-34, 1983b. Glass, C., K.H. Kim et E. Fuchs. Sequence and expression of a human type II
mesothelia! keratin. J. Cell Biol., 101: 2366-2373, 1985.
Coding, J.W. Antibody production by hybridomas. J. Immunol. Method., 39: 285-308, 1980.
Gould, V.E., I. Lee et W.W. Franks. The variable expression and coexpression of intermediate filaments in human neoplasms. In vitro, Cell. Develop. Biol., 22:3, 29A, 1986.
Gown, A.M. et A.M. Vogel. Anti-intermediate filament monoclonal antibodies: tissue-specific tools in tumor diagnosis. Surv. Synth. Pathol. Res.,
3:
369-385, 1984.Hanukoglu, I. et E. Fuchs. The cDNA sequence of a human epidermal keratin: divergence of sequence but conservation of structure among intermediate filament proteins. Cell, 31: 243-252, 1982.
Knight, J., B. Gusterson, R.R. Jones, W. Landells et P. Wilson. Monoclonal antibodies specific for subsets of epidermal keratins : biochemical and immunocytochemical characterization. Applications in pathology and cell culture. J. Pathol., 145:341-354, 1985.
Kohler, G. et C. Milstein. Continuous culture of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature, 256: 495, 1975.
Krieg, T.M., M.P. Schafer, C.K. Cheng, D. Filpula, P. Flaherty, P.M. Steinert et D.R. Roop. Organization of a type I keratin gene : Evidence for evolution of intermediate filaments from a common ancestral gene. J. Biol. Chem., 260: 10, 5867-5870, 1985.
Laemmli, U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 227: 680-685, 1970.
Leeson, T.S. et C.R. Leeson. Histologie, 2e tirage, Masson, Paris, 1976. Lowry, O.H., N.J. Rosebrough, A.L. Farr et R.J. Randall. Protein measurement
with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem., 193; 265-275, 1951. Marchuk, D., S. McCrohon et E. Fuchs. Remarkable conservation of structure
among intermediate filament genes. Cell, 39: 491-498, 1984.
Moll, R., W.W. Franke et D.L. Schiller. The catalog of human cytokeratins: patt.erns of expression in normal epithelia, tumors and cultured cells. Cell, 31: 11-24, 1982.
Naiem, M., J. Gerdes, Z. Abdulaziz, C.A. Sunderland, M. J. Allington, H. Stein et D.Y. Mason. The value of immunohistological screening in the production of monoclonal antibodies. J. Immunol. Method., 50: 145-160, 1982.
Nelson, W.G. et T-T. Sun. The 50- and 58-kdalton keratin classes as molecular markers for stratified squamous epithelia: cell culture studies. J. Cell Biol., J97: 244-251, 1983.
Nelson, W.G., H. Battifora, H. Santana et T-T. Sun. Specific keratins as molecular markers for neoplasms with a stratified epithelial origin. Cancer Res., 44: 1600-1603, 1984.
Nelson, W.J. et P. Traub. Proteolysis of vimentin and desmin by the Ca^+-activated proteinase specific for these intermediate filament proteins. Mol. Cell. Biol., 3/. 6, 1146-1156, 1983.
Osborn, M. et K. Weber. Biology of disease. Tumor diagnosis by intermediate filaments typing: a novel tool for surgical pathology. Lab. Invest., 48: 372-394, 1983.
Pauling, L. et R.B. Corey. Compound helical configurations of polypeptide chains: structure of proteins of the
a
-keratin type. Nature,171: 59-61, 1953.Pharmacia Fine Chemicals ; Protein A: Protein A-Sepharose CL-4B for cell surface and immunoglobulin studies, Suède, 1978, 8 pages.
Pruss, R.M., R. Mirsky et M.C. Raff. All classes of intermediate filaments share a common antigenic determinant defined by a monoclonal antibody. Cell,
ZU
419-428, 1981.Ramaekers, F., J. Puts, A. Kant, 0. Moesker, P. Jap et P. Vooijs. Differential diagnosis of human carcinomas, sarcomas and their
metastases using antibodies to intermediate-sized filaments. Eur. J. Cancer Clin. Oncol., 18: 12, 1251-1257, 1982.
Steinert, P.M., W.W. Idler, F. Cabral, M.M. Gottesman et R.D. Goldman. In vitro assembly of homopolymer and copolymer filaments from intermediate filament subunits of muscle and fibroblastic cells. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 78: 6, 3692-3696, 1981.
Steinert, P.M. et A.C. Steven. Splitting hairs and other intermediate filaments. Nature, 316: 767, 1985.
Steinert, P.M., A.C. Steven et D.R. Roop. The molecular biology of intermediate filaments. Cell, 4^2: 411-419, 1985.
Sun, T-T., R. Eichner, A. Schemer, D. Cooper, W.G. Nelson et R.A. Weiss. Classification, expression, and possible mechanisms of evolution of mammalian epithelial keratins: a unifying model. Dans : Cancer Cells I, The transformed phenotype, Cold Spring Harbor Laboratory, 169-176, 1984.
Towbin, H., T. Stahelin et J. Gordon. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA),
16}
4350-4354, 1979.Traub, P. Intermediate filaments, a review. Springer-Verlag, Berlin Heidelberg, 1985.
Tseng, S.C.G., M.J. Jarvinen, W.G. Nelson, J.-W. Huang, J. Woodcock-Mitchell et T-T. Sun. Correlation of specific keratins with different types of epithelial differentiation: monoclonal antibody studies. Cell, 30: 361-372, 1982.
Tsu, T.T. et L.A. Herzenberg. Solid phase radioimmune assays. Dans : Selected methods in cellular immunology, ed. B.B. Mishell et S.M. Shiigi, W.H. Freeman et Co., San Francisco, p. 373, 1980.
van Muijen, G.N.P., D. J. Ruiter, M. Ponec, C. Huiskens-van der Me y et S.O. Warnaar. Monoclonal antibodies with different specificities against cytokeratins : an immunohistochemical study of normal tissues and tumors. Am. J. Pathol., 114: 9-17, 1984.