The life course and residential mobility

Diversos trabalhos têm descrito vários efeitos do propranolol não atribuídos a sua clássica ação bloqueadora β-adrenérgica que dependem de suas propriedades anestésicas e estabilizadoras da membrana e, que podem interferir com a tradução de sinal através da membrana a nível molecular (Anderson et al.,1996; Bazan et al.,1985; Dachary-Prigent et al.,1979; Dash e Rao,1995; Gay e Murray,1991; Jamal et al.,1991; Koul e Hauser,1987; Lauritzen et al.,1994; Marshall

et al.,1975; Sozzani et al.,1992; Surewicz e Leyko,1981; Weitman et al.,1989; Weksler et al.,1977). O propranolol é uma amina lipofílica

primária, relativamente não tóxica (English,1996), que atravessa rapidamente as membranas celulares (Meier e Ruoho,1984 apud Meier et al.,1998), liga-se preferencialmente aos fosfolipídios (fosfatidilserina, ácido fosfatídico e fosfatidilinositol) em membranas celulares (Bazan et al.,1985; Dachary-Prigent et al.,1979; Surewicz e Leyko,1981; Weksler et al.,1977), acumula-se nas células por particionamento nos compartimentos acídicos intracelulares (Perry et

al.,1992), afetando também a via metabólica para ácido fosfatídico e

fosfoinositídeos de diferentes tecidos (Bazan et al.,1985; Koul e Hauser,1987; Lauritzen et al.,1994; Sozzani et al.,1992).

Os resultados deste estudo obtidos com o modelo de tratamento agudo com propranolol mostram que o propranolol produz um aumento na secreção de testosterona, dependente da concentração, em doses variando de 100 nM a 100 μM. Adicionalmente, mostram que em baixas concentrações (1 nM a 100 nM) essa droga aumenta a fosforilação da histona e que a PK-C pode ser a quinase putativa envolvida nesta reação. Foi também referido que a ativação desta quinase putativa pode estar envolvida no efeito estimulatório do

propranolol sobre a secreção de testosterona pelas células de Leydig de ratos. Este envolvimento é substanciado pelas seguintes observações. Primeiro, o achado de que o H-7, um inibidor da PK-C, bloqueou o efeito estimulatório do propranolol na secreção de testosterona, e o fato de que o aumento na secreção de testosterona exercido pelo PDBu e pelo LHRH (ativadores direto e indireto da PK- C, respectivamente - Nikula e Huhtaniemi,1988; Wanderley e Negro- Villar,1996) não foi modificado pelo propranolol, indicando o mesmo mecanismo de ação para as três drogas. Apesar de se saber que o H- 7 pode bloquear outras proteínas quinases, particularmente a proteína quinase dependente de AMPc, estes efeitos adicionais não representam um problema no caso do propranolol, uma vez que foi demonstrado que este β-bloqueador inibe a via do AMPc em células de Leydig (Tinajero et al.,1993; Wanderley,1986). Contudo, não é possível descartar a participação de outras quinases no efeito inibitório do H-7. Segundo, o propranolol inibiu a ligação de [3H]PDBu às células intersticiais testiculares. Esta inibição foi dependente da dose. Entretanto, a concentração de propranolol necessária para obter 50% de ligação do [3H]PDBu às células (5 x 106 células/tubo), foi aproximadamente 1.000 vezes maior do que aquela observada com o PDBu. Na fração DEAE-A, o estudo da ligação do [3H]PDBu mostrou um comportamento diferente quando comparado ao estudo da ligação do [3H]PDBu à preparação celular. Nas células, a inibição de 50% da ligação ocorreu com 75 μM S-propranolol, uma concentração que inibiu apenas 5% da ligação do [3H]PDBu à fração DEAE-A. Assim, a diferença marcante na concentração de propranolol e PDBu juntamente com o não paralelismo das curvas de ligação às células e à fração DEAE-A indicam que os efeitos do propranolol na ligação do [3H]PDBu às células poderia ser indireto, possivelmente aumentando a concentração de diacilglicerol ou de outros mediadores químicos para

interagir com o domínio regulatório da PK-C. Esta possibilidade se fundamenta no estudo que refere que o propranolol estimula a degradação de polifosfoinositídeos a araquidonoil-diacilgliceróis pela ativação de uma fosfolipase C específica para polifosfoinositídeo (Bazan et al.,1985). Um outro efeito conhecido do propranolol é inibir a conversão de ácido fosfatídico (PA) a diacilglicerol pela fosfohidrolase do ácido fosfatídico (PAPase) (Bazan et al.,1985; Jamal et al.,1991; Koul e Hauser,1987; Lavie et al.,1990; Lauritzen et al.,1994) aumentando a concentração de PA, o qual poderia atuar como um segundo mensageiro. Em neutrófilos, a correlação direta entre a formação de PA e a produção de superóxido durante a atividade respiratória explosiva ("burst" respiratório) sugere que o PA pode ser um segundo mensageiro na ativação da NADPH oxidase (Bauldry et

al.,1991; Rossi et al.,1990). A atividade da proteína quinase C pode

ser regulada pelo PA (Lauritzen et al.,1994; Lee e Bell,1989), e também existem algumas indicações da existência de uma proteína quinase dependente de fosfatidato (Bocckino et al.,1991; Lauritzen et

al.,1994). Outros estudos têm implicado o PA na regulação da

secreção de insulina (Lauritzen et al.,1994; Metz e Dunlop,1991), na ativação da proteína H-ras e inibição da proteína ativadora da GTPase (GAP) (Lauritzen et al.,1994; Tsai et al.,1990), na modulação da atividade da fosfolipase C (Knauss et al.,1990; Lauritzen et al.,1994; Moolenaar et al.,1986; Qian e Drewes,1991;), na proliferação e diferenciação induzidas pela interleucina-2 (Cano et al.,1992), e na ativação da quinase do fosfatidilinositol 4-fosfato (Lauritzen et al.,1994; Moritz et al.,1992). Nesse sentido, Koul e Hauser (1987) demonstraram que a forma racêmica do propranolol impede a formação de DAG dependente de IgE a partir de PA em células RBL 2H3 e que isto resulta na inibição da liberação de mediador dependente de IgE. Lin et al. (1991) referiram que o propranolol inibe a

liberação de mediadores da inflamação a partir de células RBL 2H3, de maneira não dependente de sua forma isomérica, provavelmente pela sua capacidade de inibir a ativação da PAPase. Vários estudos indicam funções potenciais do PA como segundo mensageiro em resposta a fatores de crescimento e a alguns mediadores extracelulares. Também foi encontrado que a inibição da PAPase pelo propranolol leva à potenciação da produção de O2 em neutrófilos

estimulados com o agonista do receptor putativo FMLP, sugerindo um papel para o PA como um segundo mensageiro e para a PAPase como uma enzima regulatória chave na interação entre PLC e PLD na tradução do sinal (Agwu et al.,1991; Gay e Murray,1991; Svetlov e Hanahan,1997). E, finalmente, em células de Leydig de rato, Lauritzen

et al. (1994) mostraram que o propranolol aumenta o nível de PA e

inibe a secreção de testosterona induzida pelo LH. Terceiro, em nossos estudos o propranolol ativou a proteína quinase C putativa a partir da fração DEAE-A. Entretanto, visto que o citosol das células intersticiais testiculares utilizado nos nossos experimentos como fonte de PK-C era parcial e não totalmente purificado e que a histona não é um substrato específico para a PK-C, não podemos descartar a participação de outras quinases na fosforilação da histona. Contudo, os dados já referidos aqui, sugerindo o propranolol como um inibidor da via do AMPc em células de Leydig (Tinajero et al.,1993; Wanderley,1986) não indicam a participação da PK-A na fosforilação da histona. Uma interação direta do propranolol com a PK-C putativa é inferida a partir destes estudos de atividade enzimática. Foi encontrado que quando o propranolol, ao invés de fosfatidilserina (PS), era adicionado diretamente à mistura de reação, a atividade enzimática era aumentada na mesma proporção que aumentava pela fosfatidilserina. Foi também observado que o comportamento da reação de fosforilação resultante da ação do propranolol era similar

àquele resultante da ação da PS em termos de reversão da fosforilação pelo H-7 e ausência de fosforilação na ausência de Ca2+ na mistura de reação. A possibilidade de que o aumento na atividade da PK-C putativa pelo propranolol possa ser devida à interação da droga com o domínio regulatório (o sítio de interação com lipídios cofatores) dessa quinase em um sítio diferente do sítio de interação com o PDBu é sugerida pelo achado de que o propranolol inibiu a ligação de [3H]PDBu à fração DEAE-A em apenas 5%. Foi também observado que a concentração de propranolol necessária para a ativação da proteína quinase C in vitro foi aproximadamente 10.000 vezes menor que aquela requerida para a secreção de testosterona. Presumivelmente mais propranolol é necessário para intercalar sua porção hidrofóbica na estrutura da bicamada lipídica das células de Leydig intactas, levando à ativação da proteína quinase C. Foi descrito que o propranolol inibe a PK-C ativada por PS e dioleína em neutrófilos humanos (Sozzani et al.,1992). Os autores demonstraram que diferentes concentrações de PS superam o efeito inibitório do propranolol na atividade da PK-C, sugerindo uma inibição competitiva em relação à PS. Contudo, os dados relatados por estes investigadores não foram conclusivos. Com a quantidade saturante de PS (25 μg/mL) usada no presente estudo, nenhuma inibição da atividade da PK-C foi observada.

Uma vez realizado o estudo do tratamento agudo com o propranolol sobre a secreção de testosterona, a pergunta proposta a responder foi se nas condições de tratamento crônico, que são as que mais se assemelham às do uso clínico do propranolol, seriam encontrados resultados diferentes daqueles do tratamento agudo com essa droga. Considerando as referências de disfunção sexual (impotência e incapacidade erétil) em pacientes hipertensos recebendo propranolol por período prolongado (Hogan et al.,1980; Knarr,1976), e

também que o uso prolongado de um fármaco pode levar à tolerância do organismo ao mesmo (Gilman et al., 1990), além de que a indução de respostas celulares pela ativação da PK-C é seguida de dessensibilização (por “down-regulation” da PK-C) (McArdle e Conn,1989; Niedel e Blackshear,1986; Wanderley e Negro-Villar, 1996), esperava-se encontrar depleção (“down-regulation”) dessa enzima e diminuição (dessensibilização) da resposta secretória das células intersticiais testiculares aos agentes estimulatórios que utilizam a via do DAG/PK-C.

De fato, utilizando uma preparação de células intersticiais testiculares de animais tratados cronicamente com 30 mg/Kg de propranolol durante oito dias, não foi observado o efeito estimulatório do propranolol ou dos ativadores direto e indireto da PK-C, PDBu e LHRH, respectivamente, sobre a secreção de testosterona, indicando que o tratamento crônico com propranolol dessensibilizou a via do DAG/PK-C nessas células. Entretanto, a atividade dessa enzima não foi modificada pelo propranolol com esse modelo de tratamento. Para descartar a possibilidade de que o tempo de tratamento utilizado não tenha sido suficiente para causar depleção da PK-C e, pela maior semelhança com a aplicação clínica da droga, utilizou-se o modelo de tratamento crônico descrito por Gay et al.(1990), que consiste no tratamento dos animais com 500 mg/L propranolol na água de beber durante cinco a seis semanas. Do mesmo modo que no modelo anterior, o tratamento durante cinco a seis semanas inibiu o efeito estimulatório do propranolol e do PDBu (este parcialmente) adicionados in vitro sobre a secreção de testosterona. Contudo, não inibiu o efeito estimulatório do LHRH sobre a secreção de testosterona. Isso sugere que o tratamento por via oral é mais suave que por via intraperitoneal, o que é suportado pelo fato de que os animais não morreram. O tratamento com propranolol durante cinco semanas

diminuiu significativamente a atividade da PK-C, mas isso foi devido a um aumento na atividade basal e a uma diminuição no pós-estímulo das células tratadas com propranolol, sem observar-se diferença significativa nas comparações entre os basais e pós-estímulos entre si (dos grupos controle e tratado cronicamente com propranolol). Isso sugere fortemente que a inibição total da produção de testosterona não foi devida à essa pequena diminuição na atividade da PK-C, ou que, se houve contribuição foi apenas em parte. Como foi referido anteriormente, o propranolol pode modificar diferentes efetores intracelulares. Em termos especulativos é possível inferir a partir dos dados desse estudo que provavelmente outros efetores sejam responsáveis pela dessensibilização das células intersticiais testiculares ao propranolol e aos ativadores da PK-C, e não a PK-C

per se (Figura 17). Existem várias evidências de que a

dessensibilização observada após tratamento crônico com diferentes drogas resulta da fosforilação de receptores, de proteínas G e vários efetores relacionados. Dentre as diferentes quinases envolvidas encontram-se as PK-C, PK-A, CaMKII (proteína quinase II dependente de Ca2+/calmodulina), GRK (quinases de receptor acoplado à proteína G) e as MAPKs (proteínas quinases ativadas por mitógenos) (Liu e Anand, 2001; Naor et al., 2000). De modo importante, o propranolol já foi referido como ativador da MAPK (Meier et al.,1998).

RAS GRP Ca2+ CaMK BTK ? SRC RAF1 SRC PYK/ FAK das MAPK cascatas Transcrição PIP2 ESPAÇO EXTRACELULAR M E M BRAN A P L ASM Á T ICA CITOSOL quinase-C ativada IP3 CLIVAGEM GTP proteína G ativadaq Y q receptor ativado PLC LHRH PROPRANOLOL (+/-) (+/-) Núcleo (+/-) DAG/Ca2 DAG +

Figura 17. Representação esquemática dos possíveis sítios de ação do propranolol na via que envolve a proteína quinase C para produzir dessensibilização das células intersticiais testiculares ao propranolol e aos ativadores da PK-C

Em relação à ligação do [3H]PDBu às células intersticiais testiculares, não houve diferença entre as curvas de competição correspondentes às células intersticiais testiculares de animais tratados com propranolol cinco semanas e aquelas obtidas dos animais controle, indicando a mesma afinidade para o [3H]PDBu e PDBu em ambas preparações. O tratamento crônico com propranolol não alterou a inibição, dependente da dose, da ligação de [3H]PDBu às células intersticiais testiculares resultante da adição do propranolol

in vitro. A concentração de PDBu que dá uma ligação de 50% da

máxima obtida com o PDBu marcado foi de 25 nM. Entretanto, a concentração de propranolol necessária para obter 50% de ligação do [3H]PDBu às células, foi aproximadamente 4.000 vezes maior do que

aquela observada com o PDBu (aproximadamente 100 μM de propranolol versus 25 nM de PDBu).

Quanto à resposta secretória das células intersticiais testiculares oriundas de animais tratados com propranolol aos agentes estimulatórios que utilizam a via do AMPc/PK-A, o tratamento crônico com propranolol, de forma similar ao tratamento agudo já referido em literatura, também diminuiu o efeito estimulatório do hCG (ativador indireto da PK-A) e do dbAMPc (ativador direto da PK-A) sobre a secreção de testosterona. O fato de que houve inibição do efeito estimulatório do dbAMPc sobre a secreção de testosterona indica que o local de ação do propranolol é distal à formação do AMPc. Resultados similares foram obtidos por Lauritzen et al.(1994) adicionando o propranolol diretamente a uma preparação de células de Leydig, esses autores adicionalmente demonstraram que a inibição pelo propranolol não só situa-se distal à formação de AMPc como ainda proximal à conversão do colesterol em pregnenolona. Por outro lado, Tinajero et al.(1993) também adicionando o propranolol diretamente a uma preparação de células de Leydig referiram que o propranolol causava inibição da secreção de testosterona, mas por um mecanismo diferente do observado por nós e Lauritzen et al. (1994), ou seja, eles observaram que a ação inibitória do propranolol sobre a esteroidogênese era completamente revertida pela adição de 8-bromo- AMPc, sugerindo um sítio de ação proximal à formação de AMPc.

Tendo em vista que o tratamento crônico com o propranolol pode afetar diferentes sistemas de tradução do sinal hormonal, levando a uma dessensibilização inespecífica das células intersticiais testiculares, foi realizado um experimento adicional para verificar se a via do AMPc/PK-A estava dessensibilizada. Para isso foi adicionado propranolol direta e previamente à adição do hCG e do dbAMPc à preparação de células intersticiais testiculares oriunda de animais

cronicamente tratados com propranolol. Os resultados obtidos mostraram completa inibição do efeito estimulatório do hCG e do dbAMPc, indicando que o tratamento crônico com propranolol não dessensibilizou a via do AMPc/PK-A.

VI. CONCLUSÕES

Os resultados obtidos nesse estudo mostram que o tratamento agudo com propranolol estimula a secreção basal de testosterona em células intersticiais testiculares in vitro e que esse efeito envolve a ativação de uma PK-C putativa. É possível que essa ativação resulte de uma interação direta da droga com o domínio regulatório desta quinase em um sítio diferente do sítio de interação com o PDBu. Isto é sugerido pelos resultados de atividade biológica da enzima (fosforilação da HISTONA em baixas doses de ambos os isômeros do propranolol) e pelo achado de que o propranolol inibiu a ligação de [3H]PDBu à fração DEAE-A em apenas 5%. A inibição da ligação de [3H]PDBu às células pelo propranolol pode ser devida a um aumento no diacilglicerol ou outros mediadores químicos que interagem com o domínio regulatório da PK-C. A possibilidade de participação de outras quinases ou cascata de quinases (Ex: cascata das MAPKs, da qual a PK-C também participa), nessa resposta biológica ao propranolol também deve ser considerada.

O tratamento crônico com o propranolol resulta em dessensibilização das células intersticiais testiculares aos ativadores da PK-C sobre a secreção de testosterona. Esse efeito não parece ser devido à diminuição relativa da atividade da PK-C. É possível especular que o propranolol esteja modificando outros efetores intracelulares, como as proteínas quinases ativadas por mitógenos (MAPKs).

Também conclui-se que o tratamento crônico com propranolol por via intraperitoneal foi mais eficaz na dessensibilização que o

tratamento por via oral. Provavelmente por assegurar adequado nível plasmático de propranolol.

Adicionalmente, mostrou-se que a dessensibilização causada pelo tratamento crônico com propranolol não foi um fenômeno inespecífico, já que o sistema de tradução do sinal mediado pelo AMPc/PK-A não foi dessensibilizado.

VII. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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