O encapsulamento e a caracterização das interações químicas entre o ITT e os agentes encapsulantes, a avaliação da segurança e funcionalidade em modelos in vitro e in vivo são de grande interesse para a potencial aplicação desta molécula como adjuvante no tratamento da obesidade. Nessa perspectiva, utilizou-se, neste estudo, o encapsulado sintetizado por Queiroz et al. (2018), por se apresentar promissor em relação à proteção e à potencialização dos efeitos in vitro já documentados para o ITT (CARVALHO et al., 2016; CARVALHO et al., 2019; COSTA et al., 2018; MEDEIROS el al., 2018; RIBEIRO et al., 2015). Entretanto, não se conhecia os possíveis efeitos tóxicos, sejam in vitro ou in vivo relacionados à administração do EQPI.
Para avaliar a viabilidade do encapsulamento e verificar se o EQPI sintetizado foi semelhante ao obtido por Queiroz et al. (2018) foi necessária a caracterização por diferentes métodos físico-químicos. As imagens, obtidas por meio da MEV, mostraram nanopartículas com as mesmas características morfológicas obtidas por Queiroz et al. (2018).
O tamanho de partícula obtido no presente estudo de 118 nm (17,26) foi próximo ao obtido por Queiroz et al. (2018) [109,40 nm (7,53)]. O ligeiro aumento observado pode estar relacionado ao fato de que no presente estudo a análise foi feita em água, afetando as interações eletrostáticas entre TTI e agentes encapsulantes, levando ao aumento do diâmetro das partículas (SITU; XIANG; LIANG, 2018).
Os espectros obtidos por FTIR evidenciam a atenuação dos estiramentos referentes às bandas vibracionais que refletem a presença de ligações do grupamento funcional carbonila (-C=O) presente no ITT (1399 e 1066 cm-1), o que sugere que os agentes encapsulantes estão promovendo a proteção do ativo, sendo um indicativo de que houve encapsulação. Além disso, o surgimento de novas bandas vibracionais, em 1239 e 1166 cm-1, refletem as interações químicas entre ITT, quitosana purificada e proteína do soro do leite isolada por meio das novas ligações entre C-O-C, presente na região entre 1300-1100 cm-1. Bandas vibracionais, características do PI (1655 e 1537 cm-1) e da quitosana purificada (1646 e 1555 cm-1), apresentaram-se
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deslocadas no EQPI, indicando a interação eletrostática entre os grupos carbonila dos grupos do PI e aminas da quitosana.
Em relação à média obtida para o Potencial Zeta do EQPI disperso em água, observou-se que o resultado foi semelhante ao obtido por Queiroz et al. (2018), de -38.66 (2.81) mV. Cabe ressaltar que, apesar de, no estudo mencionado, haver sido utilizada acetona como solvente orgânico para promover a dispersão das partículas, e, no presente estudo, ter sido utilizada a água, isso não foi suficiente para promover alteração nas cargas superficiais presente nas partículas. Com isso, pode-se sugerir que o EQPI apresenta-se altamente estável em pH neutro.
O EQPI apresentou alta eficiência de incorporação [(95.31% (0.31)], também observada por Queiroz et al. 2018, que sugerem que isso pode estar associado as interações eletrostáticas que ocorrem no sistema, em especial, as do complexo polissacarídeo-proteína, por meio de interações com grupamentos hidrofílicos, ligações de hidrogênio e forças de Van Der Waals (CHANPHAI; TAJMIR-RIAHI, 2016; CHANPHAI; THOMAS; TAJMIR-RIAHI, 2016). Assim, ressalta-se as fortes interações deste sistema, em especial, da quitosana com as proteínas associadas (proteína isolada do soro do leite e ITT).
Com base no exposto, no intuito de investigar a potencialidade dessas interações entre os agentes encapsulantes e o ITT em meio aquoso e em pH ácido, foi proposto, neste estudo, a filtração do ITT e do EQPI em Amicon® 100 K. Os resultados obtidos mostraram que o EQPI, após as etapas de filtração, apresentou atividade antitríptica insignificante, havendo atividade revelante apenas no retido (A5) e na ausência da filtração (A1). Esses resultados diferiram dos obtidos para o ITT, que demonstrou atividade antitríptica com e sem filtração e atividade insignificante no retido. Para o ITT disperso em HBSS e exposto a pH ácido, o mesmo resultado para ITT em água foi observado.
Entretanto, o EQPI, disperso em HBSS e exposto ao pH ácido mostrou uma liberação gradual de ITT. Cabe ressaltar que o EQPI, quando exposto a pH ácido para ser avaliado no presente estudo, estava sempre disperso em HBSS (tampão neutro), mas, no estudo in vivo o encapsulado foi administrado por gavagem no estômago (pH ácido). É necessário que, nessa condição, o ITT seja liberado para realizar suas funções bioativas já reportadas na literatura (Lima et al., 2019).
Estudos indicam que a encapsulação é um método essencial para garantir a proteção do ativo contra as condições do trato gastrointestinal e, prolongar a liberação e consequentemente o efeito bioativo do núcleo (JENNINGS et al., 2015). Portanto, o EQPI demonstrou, por meio de forte interação e liberação gradual de ITT, ser um excelente candidato a futuros estudos utilizando modelo experimental.
Essa forte interação dos agentes encapsulantes com o ITT é justificada devido às interações eletrostáticas, presentes no sistema. Chanphai e Tajmir-Riahi (2016), no estudo de encapsulação de proteínas (tripsina e o inibidor de tripsina de soja), mostraram as diversas interações que poderiam ocorrer entre essas proteínas e a quitosana, por meio de interações hidrofílicas, hidrofóbicas, ligações de hidrogênio e forças de Van Der Waals.
Autores relatam as interações de outras proteínas com quitosana. No estudo de Bekale, Agudelo e Tajmir-Riahi (2015), eles demonstram as interações entre quitosana e BSA, na formação de complexo polímero-proteína, por meio, de principalmente, de interações hidrofóbicas.
No estudo de Montero et al. (2019), o sistema particulado obtido (167– 392 nm), no qual um fármaco antitumoral foi encapsulado utilizando diferentes proporções de albumina e BSA,quando exposto a pH básico (7,5-8,0) apresentou liberação controlada. Os relatos sugerem que o aumento do pH promoveria a desprotonação de grupamentos amino presente na quitosana, o que desestabiliza as interações presentes no sistema, favorecendo a abertura de poros nas partículas, permitindo a passagem do ativo por difusão.
Embora, no presente estudo, as partículas não tenham sido dispersas no pH mencionado da citação acima vale ressaltar que o EQPI manteve o ITT confinado no sistema, o que sugere que em pH neutro o ativo e os agentes encapsulantes apresentam fortes interações eletrostáticas do sistema. Isso poderia garantir uma entrega direcionada no estômago. Entretanto, em pH ácido essa forte interação evidenciada para o EQPI provavelmente foi desestabilizada, permitindo, consequentemente, a liberação gradual do ITT conforme referido no presente estudo.
A quitosana pode prolongar a atividade terapêutica de drogas por meio de liberação controlada do ativo em local específico, maximizando a eficácia terapêutica. A natureza catiônica pode contribuir com a propriedade
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mucoadesiva, a qual facilita a aderência do material na mucosa. Portanto, compostos protegidos por esse material, como no caso do EQPI, são particularmente vantajosos para liberação em tecidos, como o gástrico e intestinal, aderindo nas membranas para promover a liberação controlada do ativo por meio dos processos de difusão e osmose. Além disso, como a mesma solubiliza em pH ácido, pode atuar como agente encapsulante de ativos que são estáveis na corrente sanguínea ou em meio extracelular, mas que degradam em contato com meio ácido, por exemplo, lisossomos celulares, tecidos lesionados ou estômago (JENNINGS et al., 2015; MOHAMMED et al., 2017).
Observa-se, nos estudos de Queiroz et al. (2018) e Medeiros et al (2018) a estabilidade da atividade antitríptica do ITT em condições de pH ácido. Dessa forma, a quitosana, presente no EQPI, possivelmente, além de promover a liberação controlada, possui também a função de proteger o agente ativo. Queiroz et al. (2018) afirmam que a quitosana interage, predominantemente, com ITT, tornando o sistema estável por meio de forças de Van der Waals e ligações de hidrogênio; interage, ainda, com algumas regiões aniônicas da proteína isolada de soro de leite.
Essas interações são provenientes do processo de encapsulamento, quando a proteína isolada do soro do leite com ponto isoelétrico entre 4.80 e 5.34 (BOUNOUS; GOLD, 1991) é submetida a um pH 5.5, juntamente com a quitosana, a qual possui carga positiva (JENNINGS et al., 2015), ao sofrer uma mudança no estado de prontonação, modificando a carga do EQPI, como pode ser observado no Potencial Zeta de -38.66 (2.81) (QUEIROZ et al., 2018). Dessa forma, é provável que o agente encapsulante da superfície do EQPI seja a proteína isolada do soro do leite, desnaturada em pH ácido (BURKE, 2000). Entretanto, nessas mesmas condições, a quitosana permanece interagindo com ITT por ser solúvel em pH baixo.
Para mensurar a viabilidade celular com relação à exposição do EQPI em diferentes concentrações, foi realizado ensaio de toxicidade in vitro, com a resazurina (Figura 7). Isso permite afirmar que o EQPI não promoveu citoxicidade às culturas celulares testadas (Caco-2 e CCD-18Co) durante o contato com as células por 24 horas. Na literatura, autores relatam as diversas áreas de aplicação da quitosana, devido à biocompatibilidade, à
biodegradabilidade, à ausência de toxicidade (AMBER JENNINGS; BUMGARDNER, 2017), o que torna esse polímero um grande atrativo para ser empregado como agente encapsulante de biomoléculas, visando a uma aplicação para humanos.
O estudo conduzido por Montero et al. (2019) analisou suas partículas quanto à viabilidade celular em diferentes linhagens de células tumorais em humanos (células de câncer de mama /MCF-7 e T-47D) e células do tumor de colo de útero humano. Durante as 24 horas de exposição, as nanopartículas testadas foram altamente citocompatíveis. Esse estudo corrobora os dados obtidos, uma vez que o EQPI foi capaz de manter uma alta viabilidade celular. Além disso, os resultados foram interpretados segundo a 10993-5 (ISO/EN10993-5, 2009), no qual, o componente é considerado tóxico quando é capaz de reduzir a viabilidade (<70%); nesse caso, o EQPI em diferentes concentrações (0.5; 2.5 e 5.0 mg/mL) em 24 horas, não foi capaz de ocasionar esse efeito. Assim, o presente estudo está em consonância ao preconizado por esse padrão.
A toxicidade das nanopartículas depende de vários fatores, incluindo tamanho, agregação, composição, cristalinidade, superfície, entre outros (BUZEA; PACHECO; ROBBIE, 2007). Apesar dessas características, se faz necessário testar a toxicidade em modelos experimentais visando traçar estratégias que viabilizem o uso dessa molécula em estudos futuros e, assim, alcançar o uso em humanos.
Sinais de toxicidade podem ser expressos por alterações na massa relativa dos órgãos, alterações hematológicas e bioquímicas (OECD / OCDE, 2010; ENV / JM / MONO, 2010; EFSA, 2018). Além disso, sabe-se da importância das análises histopatológicas na triagem toxicológica (PARASURAMAN, 2011). Sabe-se que, por meio de análise sanguínea, é possível obter informações preliminares sobre os parâmetros bioquímicos e ação de um ativo.
Assim, neste estudo, foram realizadas análises dos parâmetros hematológicos, além de avaliação das funções hepática e renal em ratos Wistar. Destaca-se que, considerando a concentração de ITT administrada no estudo de Carvalho et al., (2016) e a IC50 do EQPI apresentada por Queiroz et al (2018), além dos resultados de citotoxicidade apresentados neste estudo,
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para os estudos de toxicidade in vivo, definiu-se a dose bioativa, com a concentração de ITT em EQPI, sendo essa 10 vezes menor, daquela testada com o ITT não encapsulado (CARVALHO et al., 2016, COSTA et al., 2018; RIBEIRO et al., 2015).
Nas análises hematológicas, entre os parâmetros analisados, não foi observado diferença significativa para hemoglobina, hematócrito e contagem total de leucócitos. Relacionado aos outros parâmetros hematológicos, em um estudo conduzido por Montero (2019), que formulou nanopartículas à base de quitosana e BSA e, administradas por via intravenosa em ratos Wistar para investigar o seu efeito, observaram-se concentrações de hemoglobina (12.48 – 16.03 g/dL), em consonância com as concentrações apresentadas no presente estudo. Adicionalmente, em outros estudos de toxicidade in vivo aplicando nanotecnologia, valores semelhantes foram relatados para ratos Wistar (PÉREZ et al., 2015), apresentando concentrações que se assemelhavam àquelas adotadas como valores de referência (11.5 – 15.8 g/dL), para hemoglobina.
No estudo de Tiwari et al. (2011), alterações, na contagem total de leucócitos, foram observadas em 5 dias de tratamento, utilizando diferentes concentrações das nanopartículas de prata (40, 20, 10 e 4 mg/kg). Entretanto, embora as partículas difiram dos materiais utilizados neste estudo, vale ressaltar a importância do potencial tóxico de diferentes agentes encapsulantes. No presente estudo, conforme relatado, esse parâmetro não apresentou diferença estatística em relação ao grupo que recebeu EQPI durante 10 dias.
Entre os grupos analisados, para os parâmetros hematológicos, apenas as plaquetas apresentaram aumento significativo (p < 0,05) no grupo tratado com EQPI. No entanto, considerando a presença de quitosana, como agente encapsulante, possivelmente neste estudo, o aumento de plaquetas ocorreu devido a essa influência. Sabe-se do efeito dessa molécula sobre a concentração de plaquetas (NAKIELSKI; PIERINI, 2019). A literatura, porém, relata um efeito positivo nesse aumento, estando relacionado à homeostase da coagulação sanguínea (POGORIELOV et al., 2015).
Não obstante o aumento significativo da concentração de plaquetas apresentada neste estudo, é importante destacar que diferiu dos valores
encontrados por Montero et al. (2019) (677 – 910 × 103/μL), no entanto estava de acordo com o intervalo de referência normal (436 - 1018 × 103/μl), em estudo realizado com ratos Wistar, aplicando nanohidrogéis e nanopartículas de prata que foram obtidas comercialmente (PÉREZ et al., 2015; TIWARI et al., 2011). Vale ressaltar que as concentrações, presentes em todos esses parâmetros hematológicos, encontram-se na faixa de normalidade apresentada pelos animais eutróficos e sadios aclimatados no biotério onde se realizaram os experimentos em questão.
Quanto aos resultados pertinentes à função renal, obtidos para ureia, creatinina, proteínas totais e albumina, para os animais tratados com o EQPI, esses não diferiram, significativamente, para ureia, proteínas totais e albumina (p > 0,05). Contudo, os animais que receberam o tratamento com o EQPI apresentaram diferença estatística, para creatinina (p < 0,05). Estudos que avaliem a função renal testando nanopartículas que se assemelhem àquelas utilizadas, neste estudo, são escassos.
Desse modo, analisando parâmetros de função renal, viu-se que, no estudo de Tzankova et al. (2018), para proteínas totais, concentrações entre 62.60 - 66.83 mg/dL foram apresentados para os grupos tratados, não tratados e para o grupo controle, esses dados corroboram os apresentados neste estudo.
Analisando nanopartículas de óxido de ferro em testes in vivo de toxicidade, em formulação comercial, com diferentes tamanhos (10 nm, 10 nm e 30 nm de diâmetro) e revestimentos, os animais mostraram concentrações de creatinina na faixa de 0.074 – 0.085 mg/dL (FENG et al., 2016); esses valores estão próximos aos encontrados neste estudo e foram considerados dentro da normalidade por Feng et al. (2016). Adicionalmente, Tiwari e colaboradores (2017), analisando o efeito de nanopartículas de prata sob lesão renal em um estudo de experimental com a dose oral subcrônica dessas partículas, constataram que a creatinina sérica, trouxe concentrações entre 0.1 - 0.8 mg/dL, assim como os valores expostos no presente estudo para o mesmo parâmetro.
Diferentemente, nanopartículas de sulfeto de cádmio (5 - 9 nm), foram investigadas quanto ao potencial tóxico para parâmetros de função renal em ratos Wistar por 45 dias. Nesse estudo, os autores perceberam que o
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tratamento com as nanopartículas poderia induzir toxicidade levando à alteração funcional dos rins (RANA et al., 2018). No presente estudo, o grupo tratado com o EQPI, revelou concentrações de creatinina elevada comparadas ao grupo ao tratado (p <0,05), no entanto estava em consonância com as concentrações apresentadas por ratos Wistar eutróficos, considerados sadios, conforme Tabela 1. O aumento isolado desse parâmetro não pode ser considerado padrão ouro de lesão renal (LEVEY et al., 2016), uma vez que a albumina, ureia e proteínas totais mantiveram-se na faixa de normalidade e sem diferenças significativas entre os dois grupos analisados. Ademais, outras análises complementares seriam necessárias para confirmar qualquer comprometimento renal.
As enzimas séricas TGO, TGP, GGT e Fosfatase alcalina são marcadores essenciais para investigar a homestase hepática. Entre esses parâmetros, o grupo tratado com EQPI apresentou uma redução significativa das concentraçãoes de TGO quando comparado ao grupo sem tratamento (p < 0,05). Esse resultado se mostra inferior quando comparado ao estudo de Montero et al. (2019), que administrou nanopartículas de quitosana e BSA em ratos Wistar e o grupo controle apresentou as concentrações de TGO na faixa de 73.3 – 75.0 U/L e, os tratados entre 63.3 – 80.0 U/L. Cabe ressaltar que a redução nos níveis de TGO não foi observada no estudo de Carvalho et al. (2019), utilizando animais com diagnóstico para Síndrome Metabólica induzida por dieta HGLI e tratados com o ITT não encapsulado, sendo, portanto, um efeito diretamente relacionado à encapsulação do ITT.
No estudo de Pérez et al. (2015), valores entre 57.49 – 95.55 U/L foram considerados dentro da faixa de normalidade para TGP, visto que, entre os grupos deste estudo não houve diferença significativa (p > 0.05).
Para os resultados relacionados ao GGT, destaca-se que essa avaliação é inédita, e, por isso, não foram encontrados dados para esse parâmetro na literatura, aplicando nanopartículas. Ainda, no presente estudo, para o grupo que recebeu o EQPI, a fosfatase alcalina apresentou diferença significativa quando comparado ao grupo sem tratamento (p < 0,05). Todos esses dados, entretanto, estão de acordo com as concentrações apresentadas para esses parâmetros estudados, apontadas para os animais eutróficos (Tabela 1).
No estudo de Tzankova et al. (2018), encapsulando a quercetina, com alginato e quitosana pelo método de gelificação eletrostática, foi capaz de ocasionar um efeito hepatoprotetor, quando comparado com a quercetina não encapsulada. Isso foi evidenciado pela redução das concentrações de TGO, TGP e fosfatase alcalina.
Em um outro estudo foi também, realizado com quercetina, dessa vez nanoencapsulada pelo método de precipitação, desenvolvido para produzir suspensões de nanocristais usando coenzima Q10. Essas nanopartículas (52.7 nm) foram capazes de promover um efeito hepatoprotetor, reduzindo, significativamente, as concentrações de TGO, TGP e fosfatase alcalina, quando comparado às concentrações desses parâmetros em animais que receberam a quercetina não encapsulada (EFTEKHARI et al., 2017). Desse modo, os resultados apresentados para o EQPI, relativos a esses parâmetros fornecem indícios que o EQPI poderia estar associado a um efeito protetor de lesão hepática, vale ressaltar que os animas avaliados consumiam uma dieta de alto índice glicêmico e que a ingestão inadequada de carboidratos está relacionada à lipogênese hepática (LUZ et al., 2018).
Em face do exposto e considerando as características físico-químicas, estabilidade de interação de ITT e seus respectivos agentes encapsulantes em água, liberação gradual em pH ácido, além da segurança e das bioatividades relatadas para o ITT, convém em estudos futuros avaliar o EQPI em modelos experimentais, visando investigar a sua potencialidade para o tratamento de condições relacionadas à obesidade. É importante, ainda, avaliar os efeitos particularmente relacionados às doenças hepáticas, diante do achado revelado no estudo em questão.
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