A morfologia do material foi investigada por Microscopia Eletrônica de Varredura; sendo assim, o EQPI em pó foi disperso em acetona (PA), e gotejado em placa silício fixada em stub com o auxílio de fita de carbono. As análises ocorreram em várias ampliações, usando alto vácuo, tensão de 3.00 kV, sem metalização, em microscópio com emissão de campo (MEV-FEG) modelo Zeiss Auriga 40. Essa análise se deu no Laboratório de Caracterização Estrutural de Materiais do Departamento de Engenharia de Materiais da UFRN.
3.5.2 Espectroscopia no Infravermelho por Transformada de Fourier (FTIR)
Para levar a efeito essa análise, a quitosana purificada, proteína isolada do soro do leite, Tween 80, ITT e EQPI foram misturados a brometo de potássio (KBr - Vetec Química Fina®), triturados e prensados para a obtenção de pastilhas.
As análises de infravermelho foram registradas em transmitância e avaliadas na região do infravermelho médio (400 a 4000 cm-1). O equipamento utilizado foi um espectrofotômetro da Shimadzu, modelo FTIR-8400S, série IRAFFINITY-1, software IRSOLUTION, versão 1.60, com número de varredura de 32 e resolução 4 cm-1. Todo o procedimento foi efetivado à temperatura de 20 °C, na Central Analítica do Instituto de Química da UFRN.
3.5.3 Difração a laser
Primeiramente, foi realizada a reticulação das partículas, utilizando formaldeído para promover a desaglomeração de acordo com Queiroz et al. (2018). Foram utilizados 5,5 mg de EQPI, dispersos em 4 mL de acetona sob agitação magnética a temperatura ambiente durante 2 minutos. Posteriormente, foram adicionados 2 mL de formaldeído PA (v/v) e agitados por mais 30 minutos. Após a conclusão dessa etapa, a dispersão foi filtrada em papel de filtro qualitativo, e o material retido foi disperso em água para leitura em cubeta de vidro.
Todas as análises foram efetivadas em triplicata, composta de 5 corridas por minuto. O equipamento utilizado foi NanoBrook ZetaPlus Zeta Potencial Analyzer, e dados da mensuração de diâmetro médio e índice de polidispersão foram gerados no software Brookhaven Instruments – ZetaPALS Particle Sizing Software. Todo o procedimento foi realizado no Laboratório do Núcleo de Pesquisa em Petróleo e Gás – NUPEG do Departamento de Engenharia Química da UFRN
Os dados obtidos para diâmetro médio foram plotados no OriginPro 8 - Data Analysis and Graphing Software.
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Para a mensuração do Potencial Zeta, 10 mg de EQPI foram dispersos em 4 mL de água. As leituras foram realizadas em cubetas de vidro aclopadas a um eletrodo lateral. O procedimento ocorreu em triplicata, sendo realizadas 10 corridas por 1 minuto. A análise foi realizada no NanoBrook ZetaPlus Potential Analyzer, associado ao software Brookhaven Instruments - PALS Zeta Potential Analyzer. Os dados fornecidos pelo software foram avaliados, considerando a média e o desvio padrão. Todo o procedimento se deu, também, no NUPEG da UFRN.
3.5.5 Avaliação da eficiência de encapsulação (%)
Para monitoramento a incorporação do ITT nas partículas, foi realizada por meio de ensaios de inibição contra tripsina (KAKADE; SIMONS; LIENER, 1969), assim como estabelecido por Queiroz e colaboradores (2018).
O ITT, EQPI, e os agentes encapsulantes na ausência do ITT, foram utilizados neste ensaio. Sendo esses últimos, considerados como brancos das partículas, isso, foi realizado no intuito de comprovar atividade proveniente apenas do ITT que foi encapsulado. A massa do EQPI e dos brancos, levou em consideração a atividade do ITT capaz de inibir 100% a tripsina (1,4 mg). Assim, considerando a proporção de ITT para agente encapsulante (1:2:2 p/p/p), obtiveram-se a quantidade em mg de ITT incorporado por meio nos dos percentuais de atividade antitríptica.
A eficiência de encapsulação foi avaliada a partir da seguinte fórmula (Kumari et al.,2013):
Eficiência de encapsulação (%) = (inibidor nas partículas / total de inibidor utilizado) x 100.
Todo este procedimento foi executado, em triplicata, no Laboratório de Química e Função de Proteínas Bioativas (LQFPB) da UFRN.
3.6 Avaliação da interação do ativo e dos agentes encapsulantes do EQPI em pH neutro e ácido
Para avaliar a interação do ativo e dos agentes encapsulantes do EQPI em água (pH 7) e condição simulando o pH gástrico (3,0), foi determinada a
atividade antitríptica em diferentes etapas de filtração, utilizando o sistema de filtração em Amicon® Ultra – 500 μL Centrifugal Filters Ultracel® - 100 K. O experimento foi realizado no laboratório do Food Procesing no International Iberian Nanotechnology Laboratory (INL), Braga-Portugal.
Nesse estudo, o EQPI (70 mg/mL) e o ITT (14 mg/mL) foram dispersos e ressuspensos em água, permanecendo sob agitação constante de 300 rpm overnight (aproximadamente 12 h) a 20 °C. Posteriormente, foram submetidos à centrifugação (6.000 x g / 3 minutos a 20 °C), 500 μL foram coletados de cada sobrenadante para filtração em sistema Amicon® Ultra – 500 μL Centrifugal Filters Ultracel® - 100 K, o qual foi selecionado considerando a massa molecular aproximada do ITT (21 kDa) e da quitosana (50-190 kDa).
Para avaliar o comportamento na condição ácida, ITT e EQPI foram solubilizados/dispersos em solução salina balanceada de Hank (HBSS / Sigma Aldrich®), solução salina que manteve o meio sob condições fisiológicas de pH (aproximadamente 7,4) (Hiltz e Trope, 1991) e osmolaridade (270 a 320 mOsm/kg) e, permaneceram sob agitação constante de 300 rpm overnight (aproximadamente 12 h) a 20 °C. Posteriormente, foram submetidos às mesmas condições descritas acima, em sistema Amicon® Ultra – 500 μL Centrifugal Filters Ultracel® - 100 K.
Figura 2. Representação esquemática do sistema de filtração em Amicon® Ultra – 2 mL Centrifugal Filters Ultracel® - 100 K.
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Os processos de filtração dos sobrenadantes de ITT e EQPI, utilizando água e na condição ácida, foram repetidos três vezes, sendo obtidos três filtrados e um retido para cada grupo, denominados da seguinte forma:
A1 – Sem filtrar, não sendo submetido à filtração.
A2 – Filtrado 1 obtido da primeira filtração em Amicon®.
A3 – Filtrado 2 obtido com base no material retido na membrana após a primeira filtração submetido novamente ao processo.
A4 – Filtrado 3 obtido a partir do material retido na membrana após a segunda filtração submetido novamente ao processo.
A5 – Material retido na membrana após os três processos de filtração para obtenção dos filtrados 1, 2 e 3.
Cabe ressaltar que, em todas as etapas envolvidas no processo de filtração, os volumes obtidos (200 - 300 μL) foram ajustados com água Milli-Q para 500 μL (Figura 2). E, ao final da última filtração, o volume retido na Amicon® também foi ajustado com água Milli-Q para 500 μL. Em seguida, foram realizados testes de atividade antitríptica nas cinco fases obtidas, utilizando BApNa 1,25 mM (Nbenzoyl-DL -arginine- p -nitroanilida) como substrato, conforme metodologia descrita por KAKADE; SIMONS; LIENER (1969).
3.7 Teste in vitro de citotoxidade