Les seconds coefficients du viriel A

L'évolution des courbes d'intensité diffusée par des solutions à différentes concentrations en protéine dans un même solvant permet de qualifier globalement les interactions interparticulaires de répulsives ou d'attractives, mais la comparaison entre diverses conditions de solvant est essentiellement qualitative. Les seconds coefficients du viriel A2 quantifient l'intensité de ces interactions en les intégrant sur tout l’espace (cf. (2.12)

p. 58) et révèlent ainsi les différences entre les conditions. Ils dérivent des régressions linéaires des intensités diffusées à angle nul pour une même condition de solvant comme expliqué précédemment (cf. §2.3.1 p.58). Nous les avons déterminés à partir des trois solutions aux plus faibles concentrations en protéine (inférieures à 30 mg/ml). Rappelons qu'une valeur positive de A2 correspond à des interactions globalement répulsives et,

inversement, une valeur négative à des interactions globalement attractives.

4.2.1. Evolution de A2 en fonction de la nature et de la concentration du sel

La Figure 4.3 présente les valeurs de A2 pour la Hm MalDH en fonction de la nature

du sel et de sa concentration. Les salinités explorées (à l'exception des points isolés) correspondent globalement aux concentrations en sel accessibles, restreintes par la stabilité du sel et de la protéine (excepté (NH4)2SO4 4 M et MgSO4 au-dessus de 2 M) [Ebel et al.,

1999a]. Toutes les mesures ont été effectuées à pH 8-8.2 et à 20-25°C ou à 5°C pour les sels signalés d'un astérisque [d'après Ebel et al., 1999b]. Ces dernières valeurs peuvent toutefois être comparées aux autres puisque nous avons vu que l'effet de la température est extrêmement ténu pour ces sels. Nous le constatons d'ailleurs en (NH4)2SO4 où les valeurs aux

deux températures s'accordent bien compte tenu de leur précision. Cette observation souligne d'ailleurs la reproductibilité des résultats d'une expérience à l'autre, même avec des

définis car ils correspondent à des intensités qui n'évoluent quasiment pas avec la concentration en protéine. L'erreur portée sur la Figure 4.3 déterminée lors de la régression linéaire est sans doute sous-estimée pour ces valeurs, comme en (NH4)2SO4 3 M à 25°C. Nous

considérerons par la suite que les deux valeurs de A2 pour cette condition saline décrivent le

même état d'interaction.

On peut distinguer deux classes de solvant. La première est constituée des sels suivants : NaCl, CsCl, KF et NaCH3CO2 pour lesquels A2 conserve des valeurs positives

proches de 4 10-8 _mol.l.g-2 _{à toute salinité. Pour ces sels, A}

2 diminue d'une manière monotone

avec la concentration en sel, en tenant compte de la précision des valeurs.

-2 10-8 0 2 10-8 4 10-8 6 10-8 0 1 2 3 4 5 6 NaCl * CsCl KCl KF * NaCH₃CO₂ * (NH₄)₂SO₄ * (NH₄)₂SO₄ MgSO₄ MgCl₂ * A 2 (mol.l.g -2 ) [sel] (M)

Figure 4.3 : Evolution du second coefficient du viriel A2 de la Hm MalDH en fonction de la nature et de la

concentration du sel. Les mesures ont été effectuées à pH 8-8.2 et à 20-25°C (réf. NaCl : D22 98.10, CsCl : D22 99.9, KCl : D11 98.2, (NH4)2SO4 : D22 00.10, MgCl2 et MgSO4 : D11 98.7), ou à 5°C pour les sels marqués d'un

astérisque (réf. D11 97.4, d'après [Ebel et al., 1999b]).

En revanche, A2 évolue fortement en (NH4)2SO4, MgSO4 et MgCl2 qui forment la

seconde classe de solvants. Il varie de manière non monotone avec la concentration en sel, entre des valeurs nulles ou faiblement négatives et des valeurs positives de l'ordre de 3- 4 10-8

mol.l.g-2

se stabiliser à plus forte salinité. A l'opposé, en (NH4)2SO4, il est constant entre 1 et 2 M puis

diminue subitement au-delà, pour atteindre des valeurs proches de zéro à 3 M. D'ailleurs, la Hm MalDH précipite à 100 mg/ml à cette concentration de (NH4)2SO4 et à 10 mg/ml à 4 M

(ce qui explique l'absence de détermination de A2 pour cette salinité) [Ebel et al., 1999b].

L'évolution de A2 en fonction de la salinité peut donc être très différente selon le sel,

ce qui traduit clairement une dépendance marquée des interactions protéine – protéine à la composition du solvant.

4.2.2. Effet de charge : pH et mutant de la Hm MalDH

Afin d'évaluer l'influence sur les interactions interparticulaires de la charge de la protéine, nous l'avons fait varier en utilisant deux approches. La première, facilement réalisable, est la variation du pH de la solution. Nous avons donc enregistré les courbes de diffusion puis déterminer les A2 en NaCl 4 M et MgCl2 0.5 et 1 M à divers pH : 6.5, 8 et 9,

pour lesquels la charge structurale calculée de la Hm MalDH est environ de -140, -158 et -165 respectivement. Cette gamme de pH est limitée par la plus faible stabilité de la protéine à pH acide [Madern et Zaccai, 1997]. La deuxième approche consistait en l'utilisation du mutant E121K de la Hm MalDH où les quatre acides glutamiques 121 du tétramère ont été mutés en lysine [Madern, communication personnelle]. La différence de charge est donc supposée être de +8. Les valeurs de A2 obtenues pour les différentes conditions sont résumées dans le

Tableau 4.1. Sel pH 6.5 pH 8-8.2 pH 9 NaCl 4 M 4 ±0.2 3.2 * 3.4 ±0.7 NaCl 4 M (E121K) 4.9 ±0.6 MgCl2 0.5 M 1.2 ±0.4 0.85 * MgCl2 1 M 3.1 ±0.1 2.7 *

Tableau 4.1 : Seconds coefficients du viriel A2 (en 10-8 mol.l.g-2) pour la Hm MalDH native et un mutant

(E121K) en fonction du pH pour différents sels, à 20-25°C (réf : D22 98.10, D11 98.7, D11 98.2) ou à 5°C pour les valeurs marquées d'un astérisque (réf. D11 97.4, d'après [Ebel et al., 1999b]).

Au vu de la précision obtenue, on peut considérer qu'une variation de pH de 6.5 à 8- 8.2 ou 9 ne modifie les valeurs de A2 ni en NaCl 4 M (pour la forme sauvage ou mutée de la

protéine), ni en MgCl2 0.5 ou 1 M. Dans ces sels, les interactions protéine – protéine ne

semblent donc pas être affectées par ces variations de charge de la macromolécule. Cette même variation induit cependant une modification majeure de la stabilité de la Hm MalDH : elle est stabilisée à plus bas sel à pH 8 qu'à pH 7 [Madern et Zaccai, 1997]. Cette variation n'impliquerait donc que la structure interne de la protéine.

4.2.3. Effet du D2O

En diffusion de neutrons, l'eau lourde D2O (ou 2

H2O) *

est souvent utilisée comme solvant principal à cause de la très faible diffusion incohérente de l'atome D par rapport à H ce qui augmente la précision des mesures (pour un même temps de comptage). Nous avons effectué des mesures de diffusion de neutrons pour des solutions de Hm MalDH en KCl 3 M en H2O et en D2O afin de savoir si cet échange influençait dans notre cas les interactions

protéine – protéine. Les valeurs des A2 obtenus sont de 5.2 (±0.2) 10 -8

en H2O et

5.9 (±0.1) 10-8

mol.l.g-2

en D2O. Cette différence significative montre que cet échange n'est

pas sans conséquence sur les interactions protéine – protéine. Il a été montré que le D2O

modifiait les interactions protéine – protéine et diminuait la solubilité du lysozyme et de l'inhibiteur de la trypsine pancréatique bovine [Gripon et al., 1997; Budayova-Spano et al., 2000]. La Hm MalDH en KCl semble donc être un contre-exemple puisque A2 – et sans doute

la solubilité de la protéine – est plus élevé en D2O qu'en H2O. De plus, le D2O affecte la

stabilité des protéines et notamment augmente celle de la Hm MalDH à bas sel [Bonneté et al., 1994; Madern et Zaccai, 1997]. Comme notre intention est de mettre en relation les interactions interparticulaires et les interactions protéines – solvant qui ont été caractérisées en H2O, nous avons continué de mener nos expériences de diffusion de neutrons en H2O,

malgré les avantages du D2O.

*2_{H est un isotope de l'atome H. Il possède un neutron supplémentaire et est donc formé d'un proton, d'un}