5.1. Présentation de l'article
La Hm MalDH a été cristallisée dans une solution aqueuse de NaCl et de méthyl-2- pentanediol-2,4 (MPD) [Dym et al., 1995; Richard et al., 1995]. La cristallisation est généralement associée à l'augmentation des concentrations de la protéine et de l'agent précipitant, conduisant à une solution sursaturée en protéine. Dans notre protocole, la Hm MalDH cristallise par dilution, selon la méthode de diffusion de vapeur. La goutte initiale contient la protéine en présence d’eau, de NaCl et de MPD. Elle est mise en équilibre avec un réservoir ne contenant que du MPD aqueux. La vapeur d'eau diffuse du réservoir vers la goutte et la dilue. Il faut noter que selon la concentration en sel et en MPD, le système NaCl – MPD – H2O est mono-, bi- ou triphasique. Dans notre protocole, la goutte initiale est
biphasique [Richard et al., 1995]. Nous avons tout d’abord cerné les zones du diagramme de phases où la protéine est stable, puis celles où sa solubilité est fortement diminuée. Nous avons ensuite évalué le second coefficient du viriel de la Hm MalDH dans divers mélanges NaCl – MPD – H2O monophasiques. Enfin, nous avons décrit le cheminement complexe de la
protéine dans le diagramme de phases, lors du processus de cristallisation par dilution. Ces résultats nous permettent de comprendre les raisons de la cristallisation de la Hm MalDH. Ils sont brièvement rappelés ci-dessous et développés dans l’article ci-joint : “ Understanding the crystallisation of an acidic protein by dilution in the ternary NaCl – 2-methyl-2,4- pentanediol – H2O system ” [Costenaro et al., 2001].
La Figure 5.1 comprend l’essentiel de nos résultats.
Dans un premier temps, nous avons déterminé la stabilité apparente de la protéine dans diverses solutions aqueuses monophasiques de NaCl et de MPD en interprétant des mesures d'activité résiduelle (activité enzymatique après 18 heures d'incubation) en termes de protéine repliée ou dénaturée. En NaCl et sans MPD, la Hm MalDH est dénaturée en dessous de 2 M (symbole “ i ” dans la Figure 5.1). L'addition progressive de MPD permet à la protéine de rester active et stable à des concentrations salines de plus en plus faibles : elle est par exemple
toujours active en NaCl 0.3 M avec 30% de MPD*
. En présence de NaCl, le MPD est donc un stabilisant de la Hm MalDH. [MPD] (% v/v) [NaCl] (M) – – + P i – + + + + + + ++ liquide-liquide et sel précipité 1 liquide liquide-liquide 0 20 40 60 80 100 0 1 2 3 4 2 3 1
Figure 5.1 : Cheminement de la Hm MalDH dans le diagramme de phases NaCl – MPD – H2O lors de sa
cristallisation. Les traits pleins représentent les courbes de coexistence de phases à 22°C [d’après Richard et al., 1995]. Les courbes en pointillés délimitent les zones où la Hm MalDH est inactive (i) et où elle précipite (P) à 25.5 mg/ml à température ambiante. Les valeurs expérimentales du second coefficient du viriel A2 sont indiquées
par “ ++ ” pour des valeurs supérieures à 4 10-5 mol.l.g-2, par “+” pour des A
2 compris entre 2 et 4 10-5 mol.l.g-2 et
par “ – ” et “ – – ” pour des A2 d’environ -2 et -10 10-5 mol.l.g-2. La goutte initiale () est constituée de deux
phases (z). Durant la dilution globale de la goutte (flèche grasse hachurée), la composition de la phase contenant la protéine suit le cheminement 1, 2 et 3.
Dans un deuxième temps, des mesures de solubilité apparente à 25.5 mg/ml ont montré que la protéine ne précipite (symbole “ P ”) qu'en dessous de 1 M de NaCl avec au moins 30% de MPD.
La solubilité, la précipitation et la cristallisation des protéines sont reliées à la valeur et au signe du second coefficient du viriel A2 [George et Wilson, 1994; Ebel et al., 1999b]. Nous
avons donc mesuré les valeurs de A2 pour la Hm MalDH dans de nombreuses solutions
monophasiques de NaCl – MPD – H2O, par diffusion de neutrons aux petits angles. A
* Les concentrations en MPD sont exprimées comme le volume utilisé de MPD pur divisé par le volume final de
concentration constante de MPD, A2 varie peu avec la concentration en sel. Par contre pour
une concentration en NaCl donnée, il décroît de manière notable lorsque la concentration en MPD augmente, ce qui correspond à une augmentation des attractions protéine – protéine. En NaCl 1.5 M, A2 évolue de 2.6 10 -5 mol.ml.g-2 en MPD 5%, à -10 10-5 mol.ml.g-2 en MPD 30%. Nous avons aussi déterminé les compositions des phases de deux solutions biphasiques de NaCl – MPD – H2O dont celles de la goutte initiale. Finalement, des mesures
d'absorbance pour les deux phases d'une solution biphasique de NaCl et de MPD contenant de la Hm MalDH indiquent très clairement que la protéine n'est présente que dans la phase saline. L'ensemble de ces résultats nous permet de décrire le chemin de la cristallisation de la Hm MalDH sur le diagramme de phases NaCl – MPD – H2O.
Au début du processus de dilution globale de la goutte (1 sur la Figure 5.1), la phase fortement saline et pauvre en MPD qui contient la protéine évolue vers une composition moins riche en protéine et en sel, mais plus concentrée en MPD (2). La Hm MalDH est ainsi progressivement conditionnée d'interactions protéine – protéine répulsives (A2 > 0) vers des
interactions modérément attractives (A2 < 0). La goutte devient ensuite monophasique. La
nucléation se produit alors dans une solution homogène où A2 est raisonnablement extrapolé à
-20 10-5
mol.ml.g-2
. Cette valeur est en accord avec celles qui correspondent aux conditions de cristallisation de nombreuses protéines [George et Wilson, 1994]. L'équilibration se poursuivant, la protéine, le sel et le MPD sont tous trois dilués (3 sur la Figure 5.1). Les interactions protéine – protéine deviennent moins attractives, ce qui devrait conduire la protéine, de conditions propices à la nucléation, vers des conditions avantageant la croissance cristalline et donc favoriser l’apparition d’un nombre limité de cristaux de taille néanmoins raisonnable. Ce cheminement complexe permet de préserver la stabilité de la protéine durant tout le processus.
La Hm MalDH a été cristallisée selon le même protocole dans des mélanges de sel – MPD – H2O avec le KCl et le KF [Richard, 1998]. Le principe de ce protocole pourrait être
adapté pour la cristallisation de macromolécules stables et solubles à forte salinité et (ou) peu solubles à bas sel.
5.2. Article 2 : Understanding the crystallisation of an acidic protein
by dilution in the ternary NaCl – 2-methyl-2,4-pentanediol – H
2O system
*Lionel Costenaro, Giuseppe Zaccai and Christine Ebel
Journal of Crystal Growth, 232(1-4) (2001), 102-13.
* Les références citées dans l'article sont listées à la fin de celui-ci, indépendamment de la bibliographie du
Journal of Crystal Growth 232 (2001) 102–113