Les principales techniques de transfection

Les macromolécules d’ADN chargées négativement ne pouvant être délivrées dans les cellules cibles par simple diffusion, il est nécessaire d’utiliser des techniques telles que la lipofection, la magnétofection, l’électroporation, la biolistique ou la micro-injection.

III.2.1. Lipofection et magnétofection

La lipofection consiste à utiliser des liposomes cationiques comme vecteurs pour transfecter des cellules eucaryotes. L’ADN est encapsulé dans des vésicules phospholipidiques artificielles pour former des complexes appelés lipoplexes (Fig. 20A). Les charges positives présentes à la surface des lipoplexes vont permettre une interaction avec les protéoglycanes chargés négativement présents à la surface des cellules. Ils sont ensuite

Figure 20. Principe de la lipofection. (A) Schéma expliquant la formation des lipoplexes, complexes liposomes cationiques/ADN. Elle repose sur une condensation de l’ADN chargé négativement au niveau des groupements phosphates avec la bicouche phospholipidique chargée positivement en raison des têtes cationiques (d’après Felgner et al., 1997). (B) Mécanisme de transfection par lipofection. Les lipoplexes sont transférés dans la cellule cible au cours de différentes étapes. 1. Endocytose des lipoplexes dans la cellule cible. 2. Formation des endodomes. 3. L’acidification du contenu des endosomes n’a aucun impact sur l’ADN car il est protégé par le lipoplexe. 4. L’accumulation des composés cationiques dans les endosomes protège contre la dégradation par les enzymes endosomales et induit le relarguage de l’ADN plasmidique à proximité du noyau. 5. Translocation dans le noyau par l’intermédiaire de pores nucléaires. 6. L’ADN contenu dans le noyau peut se décompacter et être reconnu par la machinerie cellulaire pour être transcrit (d’après Vijayanathan et al., 2002).

A.

B.

Figure 21. Principe de la magnétofection. Les acides nucléiques sont incubés avec les nanoparticules magnétiques pour former des complexes nanoparticules/ADN. Ces complexes sont mis en contact avec les cellules à transfecter qui sont ensuite placées entre la source magnétique et les acides nucléiques associés à des nanoparticules magnétiques. Le champ magnétique induit un mouvement des vecteurs vers la surface des cellules et leur accumulation à la surface des cellules permet d’améliorer l’efficacité de transfection. L’entrée dans les cellules n’est pas due aux nanoparticules magnétiques mais est identique à la lipofection (endocytose et voie d’entrée naturelles) (d’après Plank et al., 2003).

cellule acides nucléiques

champ magnétique Particules magnétiques

internalisés dans la cellule par endocytose, les composés cationiques protégeant l’ADN de la dégradation par les enzymes lysosomales. L’accumulation de ces complexes déstabilise les endosomes ce qui induit une libération de l’ADN à proximité du compartiment nucléaire. La translocation de l’ADN dans le noyau se fait alors via les pores nucléaires (Fig. 20B). Les lipoplexes peuvent également pénétrer dans la cellule cible par fusion avec la membrane plasmique. La lipofection est couramment utilisée pour la transfection des cellules de mammifères en culture mais très rarement pour la transfection des parasites eucaryotes (Strain, 2006). Une utilisation pour la transfection des trophozoites d’Entamoeba histolytica a cependant été décrite (Olvera et al., 1997).

Une adaptation de la lipofection, appelée magnétofection, a récemment été développée. Elle consiste à exercer une force magnétique sur des nanoparticules magnétiques auxquelles sont associées les molécules d’ADN d’intérêt. Cette technique de transfection peut se faire en présence ou non d’un agent de lipofection. Composées d’oxyde de fer, les nanoparticules présentent une taille compatible (50 à 200 nm) avec l’incorporation cellulaire et la progression intracellulaire. Les cellules à transfecter sont incubées avec les complexes billes magnétiques/ADN puis placées sur la source magnétique (Fig. 21). Le champ magnétique induit alors un mouvement des complexes vers les cellules cibles favorisant alors leur accumulation à la surface des cellules. L’entrée dans les cellules se réalise comme dans le cas des lipoplexes. Les nanoparticules magnétiques s’accumulent ensuite dans le noyau (revue par

Plank et al., 2003). Cette technique permet d’augmenter l’efficacité de transfection de

cellules de mammifères car l’application du champ magnétique favorise le contact entre une plus grande quantité de vecteur et la surface des cellules cibles (Sherer et al., 2002 ; Krotz et

al., 2003). A l’heure actuelle aucune utilisation de la magnétofection pour la transfection de

III.2.2. L’électroporation (ou électroperméabilisation)

Elle consiste à appliquer une brève impulsion électrique qui dépolarise la membrane plasmique et crée une ouverture temporaire de pores appelés électropores. Durant cette période, la membrane est très perméable à de petites molécules comme les ions, l’eau mais aussi à des macromolécules comme l’ADN. La cellule va ensuite refermer les électropores de façon spontanée, piégeant l’ADN à l’intérieur du cytoplasme de la cellule. Cette méthode non invasive et non chimique n’altère pas la structure biologique et la fonction de la cellule cible. Elle est largement utilisée lors de la transformation de bactéries et de parasites protozoaires (Miller, 1994 ; Davis-Hayman et Nash, 2002 ; Gardiner et al., 2003).

Créant des pores au niveau de la membrane, l’électroporation rend les cellules très sensibles à l’osmolarité et la composition ionique du milieu. Une meilleure survie des cellules est observée lorsqu’elles sont placées dans un environnement qui ressemble à la composition ionique intracellulaire. Il facilite l’élimination des électropores et donc la restauration de la membrane (van den Hoff et al., 1992). L’efficacité de la transfection de certains parasites tels que T. gondii ou Plasmodium est ainsi améliorée en présence d’un tampon appelé « cytomix » qui permet de limiter la fuite des composants du cytoplasme et de protéger les membranes contre l’oxydation (Soldati et Boothroyd, 1993 ; Goonewardene et al., 1993).

Récemment, une adaptation de l’électroporation, appelée nucléofection, a été décrite. Cette méthode d’électroporation permet de délivrer directement l’ADN dans le noyau des organismes cibles. Utilisée chez Plasmodium berghei et P. yoelii, la nucléofection permet d’augmenter considérablement l’efficacité de transfection d’un facteur 10⁴ à 10⁶ (Janse et al.,

Figure 22. Illustration du canon à particules utilisé pour la biolistique. (A) La chambre présente un

levier permettant de stopper le vide (1) ainsi qu’une jauge de vide (2) reliée à une sortie de la chambre menant à la pompe à vide (VP). Une valve permettant l’entrée d’air (3) est utilisée pour égaliser la pression dans la chambre après l’application du vide. Le vide est appliqué par un tuyau connecté directement à la valve solénoïde (4). Celle-ci est reliée au haut de la chambre par un système (qcn et cac) assurant un attachement/détachement rapide et facile de la valve à la chambre de micro-projection. (5) Un relai (fixé à 50 ms) contrôle la sortie d’hélium à partir de valve solénoïde. (B) Agrandissement de la partie supérieure de la chambre de micro-projection montrant l’emplacement des plateaux à différents niveaux (flèches). Le niveau 1 (1) est utilisé pour placer une plaque dite de dispersion (DG). La seconde plaque placée au niveau 3 (2) est utilisée pour déposer les échantillons pour la transfection. (C) Image du détendeur (cartouche) ouvert contenant un filtre sur lequel de l’ADN lié à des billes d’or a été déposé au centre du filtre (région noire indiquée par une flèche, d’après Ibrahim et al., 2000).

III.2.3. La biolistique (ou balistique biologique)

La biolistique correspond au bombardement de cellules par des microbilles de métal (or ou tungstène) à l’aide d’un canon à particules (Fig. 22). Ces microbilles (0,2 à 1 µm de diamètre), enrobées d'ADN, sont ainsi projetées à grande vitesse et peuvent traverser la membrane ou la paroi des cellules à transformer. Une fois dans le noyau, l’ADN peut se séparer de la bille micro-porteuse et être reconnu par la machinerie transcriptionnelle de la cellule cible. Cette technique est utilisée pour la transformation de plantes, de tissus animaux, de bactéries, de levures, de champignons et d’organelles comme les mitochondries (Lorence

et Verpoorte, 2004 ; Smith et al., 2002 ; Johnston et DeVit, 1996 ; Johnston et al., 1988).

Elle est également applicable à des parasites tels que Leishmania (Sbicego et al., 1998).

III.2.4. Les autres techniques de transfection

La micro-injection consiste à introduire de l’ADN dans une cellule à l’aide d’une aiguille microscopique. Cette technologie est très utilisée pour créer des animaux transgéniques. Elle est également utilisée dans le cas de la paramécie pour micro-injecter des transgènes directement dans le macro-noyau (Gilley et al., 1988).

Les vecteurs viraux, utilisés pour la transfection de cellules de mammifères, sont principalement des rétrovirus ou des adénovirus recombinants. Une partie du génome viral essentiel à la réplication du virus est remplacée par la cassette d’expression. Les virus rendus inaptes pour la réplication infectent la cellule cible : la transcription du gène d’intérêt a lieu par la machinerie de transcription de la cellule hôte comme dans le cas d’un virus normal. Les rétrovirus présentent en plus la capacité d’insérer leur génome dans celui de l’hôte (revue par

Hendrie et Russell, 2005). Chez les protozoaires, l’utilisation de virus a été décrite pour la