Intégration dans le génome

Chez certains organismes comme Giardia lambia ou Entamoeba histolytica, des vecteurs maintenus sous forme d’épisomes peuvent permettre d’obtenir des transformants stables. Chez T. gondii ou P. falciparum, en présence d’agents de sélection, les vecteurs circulaires peuvent être maintenus sous forme d’épisomes mais ils sont rapidement perdus au cours des divisions en raison d’une mauvaise ségrégation entre les cellules filles. Ceci explique une croissance lente en présence d’agents de sélection et une perte rapide des vecteurs lorsque la sélection est éliminée. L’introduction du transgène dans le génome de manière aléatoire ou par recombinaison homologue aboutit à une expression stable des transgènes et permet de résoudre les problèmes liés à l’instabilité des épisomes.

III.4.2.1. Chez les Trypanosomatidae

Chez T. brucei ou Leishmania major, la transfection avec des vecteurs sous forme linéaire permet d’obtenir des transformants stables exclusivement par recombinaison homologue (Lee et van der Ploeg, 1990 ; Cruz et Beverley, 1990). Les séquences adjacentes homologues, même courtes (1 à 2 kb) suffisent à réaliser une recombinaison homologue (Tobin et Wirth, 1992). Les Trypanosomatidae existent sous forme diploïde ce qui nécessite, pour obtenir des mutants nuls, d’inactiver les deux allèles. Une inactivation séquentielle d’un

allèle puis du second est réalisé grâce à l’utilisation de deux gènes de sélection indépendants (Cruz et al., 1991).

III.4.2.2. Chez Toxoplasma gondii

Les premières expériences de transformations stables de T. gondii ont montré que l’intégration de molécules d’ADN étranger dans le génome a lieu préférentiellement de façon aléatoire (Donald et Roos, 1993). Ceci pose le problème d’une intégration dans un gène essentiel entrainant un phénotype létal. Cependant, l’intégration par recombinaison non homologue présente un coté positif car elle peut être utilisée pour faire de la mutagenèse aléatoire, ou pour cibler des gènes comme par exemple hxgprt à l’aide d’une stratégie de sélection négative : lorsque le transgène est introduit dans le gène codant HXGPRT, les parasites résistent en effet à l’action de la 6-TX (Fig. 24, Donald et al., 1996). La même stratégie a été utilisée pour cibler le gène uprt et caractériser des parasites capables de résister à la 5-FDUR (Donald et Roos, 1995). Ces deux stratégies sont basées sur l’utilisation des sélections négatives décrites précédemment.

Cependant, lorsque la région d’homologie avec le locus d’intérêt est suffisamment grande (plusieurs kb), l’efficacité de recombinaison homologue par double crossing-over est améliorée. Ainsi, dans le cas du gène dhfr-ts, un fragment de 16 kb permet d’augmenter l’efficacité de recombinaison par double crossing-over (Donald et Roos, 1994). De façon générale, la présence de régions flanquantes d’environ 2 à 2,5 kb est nécessaire pour que la recombinaison homologue par double crossing-over ait lieu de façon efficace. La fréquence de recombinaison homologue restant cependant faible, une autre stratégie a été développée. Ce système est basé sur deux étapes qui utilisent le gène codant HXGPRT comme sélection positive / négative. Un vecteur présentant le gène hxgprt flanqué par un grand fragment d’ADN encadrant le gène d’intérêt est introduit de façon stable au niveau du locus du gène endogène d’intérêt sous une pression de sélection positive. Les pseudo-diploïdes (gène

Figure 26. Recombinaison site spécifique à l’aide du système Cre-lox. (1) Le gène codant la recombinase Cre est placé sous le contrôle d’un promoteur de l’organisme d’intérêt (Psp). (2) La recombinase Cre, exprimée sous forme de dimère, va interagir avec les deux sites spécifiques loxP encadrant le gène d’intérêt B. Les sites loxP sont constitués de répétitions de 13 pb inversées associées à une séquence core de 8 pb. (3) L’association ADN-recombinase catalyse une recombinaison homologue à l’intérieur des séquences core de 8 pb. (4) Selon l’orientation des sites loxP, la recombinaison aboutit soit à la délétion soit à l’inversion du fragment d’ADN bordé par les sites loxP. Le site loxP toujours présent dans le génome peut être utilisé pour une nouvelle recombinaison et donc l’insertion d’une nouvelle séquence (d’après Gossen et Bujard, 2002).

loxP loxP

(1)

(3) (4) (2)

Figure 27. Stratégie de remplacement par simple crossing-over à l’origine d’organismes pseudo-diploïdes chez P. falciparum. Le plasmide contient une séquence cible (Target) qui est partiellement identique à la séquence sauvage du gène endogène du parasite puisque dans la partie 3’ du transgène, sont introduites des mutations (rectangle gris avec les astérisques indiquant les mutations). Une séquence de terminaison de transcription est présente (3’). Après transfection, une procédure cyclique sélection/perte de sélection est réalisée pour favoriser l’intégration dans le génome. De façon générale, les plasmides s’intègrent par recombinaison par simple crossing-over au niveau de la séquence endogène cible : il en dérive un gène entier, contenant les mutations d’intérêt, placé sous le contrôle transcriptionnel du promoteur endogène et de la séquence 3’ introduite. Une copie tronquée (truncated gene) est également présente dans le génome mais elle n’est pas exprimée en raison de l’absence de promoteur. Ceci est à l’origine d’organismes pseudo-diploïdes. Un autre inconvénient de la recombinaison par simple crossing-over est la persistance du corps du plasmide au locus d’intérêt après recombinaison (modifié d’après Crabb, 2002).

sauvage et transgène séparés par le vecteur) sont éliminés en incubant les parasites en présence de 6-TX. Une recombinaison intrachromosomique permet d’exciser le corps du plasmide qui contient le marqueur produisant ainsi des parasites résistants à l’action de 6-TX (Donald et Roos 1998).

Une autre stratégie alternative non basée sur la recombinaison homologue consiste en l’expression des composants du système sites spécifiques de la recombinase Cre-loxP du bactériophage P1. Dans cette stratégie, le gène cible est placé entre deux sites loxP de 34 pb en orientation directe. Cette construction s’insère de façon aléatoire dans le génome de T.

gondii. L’expression transitoire de la recombinase Cre permet de réaliser une recombinaison

entre deux sites loxP : le gène cible peut alors être délété de façon efficace et sélective (Fig.

26). L’activité de la recombinase Cre est réversible ce qui permet de réaliser ensuite une

recombinaison intégrative spécifique d’un ADN exogène, au niveau d’un site loxP libéré au cours d’une précédente excision, éliminant ainsi le problème des intégrations aléatoires dans le génome de T. gondii. Cette stratégie permet aussi d’éliminer un gène de sélection ce qui facilite la réutilisation ultérieure de ce gène de sélection (Brecht et al., 1999).

III.4.2.3. Chez Plasmodium falciparum

L’intégration des vecteurs a généralement lieu par recombinaison homologue au niveau du locus d’intérêt sans contrainte de taille. Il semble que la recombinaison soit favorisée lorsque les vecteurs sont sous forme circulaires (Wu et al., 1996). La plupart des expériences réalisées chez P. falciparum montrent une intégration par simple crossing-over ce qui permet de réaliser des remplacements alléliques ou des inactivations ciblées de gènes (Fig. 27). L’intégration par simple crossing-over présente certaines limites car la nature même de cette intégration implique que le corps du vecteur reste dans le génome au niveau du locus

d’intégration et cette stratégie crée des pseudo-diploïdes puisqu’une seule copie est intacte et peut s’exprimer (Crabb et Cowman, 1996).

La réalisation d’un double crossing-over chez P. falciparum implique l’incorporation dans le vecteur de transfection d’une seconde cassette, codant pour un marqueur de sélection. Le gène codant la thymidine kinase (TK) du virus de l’herpès simplex qui confère une susceptibilité au gancyclovir peut être utilisé en tant que sélection négative. En association avec un marqueur de sélection positif comme DHFR, il est également possible d’obtenir des recombinaisons homologues par double crossing-over (Duraisingh et al., 2002).

Une autre stratégie utilisant un élément transposable permet d’obtenir une intégration dans le génome de P. falciparum. Les éléments transposables n’existent pas de façon naturelle chez la plupart des eucaryotes inférieurs et notamment chez P. falciparum. Le gène conférant la résistance à la pyriméthamine (dhfr) est placé entre les séquences ITR de l’élément transposable de lépidoptère piggybac, base pour l’insertion dans le génome. Un vecteur helper porte le gène codant la transposase sous le contrôle de séquences régulatrices de Plasmodium.

Piggybac cible exclusivement la cible tétra nucléotidique TTAA lui permettant de s’intégrer à

plusieurs endroits dans le génome. Cette stratégie permet de réaliser des études de mutagenèse à grande échelle mais les gènes essentiels ne peuvent être ciblés (Balu et al., 2005).