Les principales familles de régulateurs de P aeruginosa

aeruginosa

a. Les facteurs sigma

Les facteurs sigma (σ) sont des sous-unités de l’ARN polymérase permettant la reconnaissance spécifique des promoteurs et participant à l’initiation de la transcription.

Le génome de P. aeruginosa possède un grand nombre de gènes codants pour des facteurs sigma, 24 identifiés chez PAO1 et 26 chez PA14, dont RpoD (σ70_{) qui est responsable de l’initiation}

de la transcription de la plupart des gènes « de ménage » essentiels à la survie de la bactérie (Potvin et al., 2008; Chevalier et al., 2018). P. aeruginosa dispose également de facteurs sigma alternatifs dont les σ ECF (extracytoplasmic factor) activés par des signaux environnementaux et modulant, entre autres, la virulence bactérienne (Potvin et al., 2008). σVreI _{(virulence regulator}

involving ECF sigma factor), par exemple, est un facteur sigma ECF appartenant au système de Signalisation de Surface Cellulaire (CSS, cell surface signaling) PUMA3 et qui induit la toxicité de P. aeruginosa en régulant l’expression de gènes codant pour des facteurs de virulence en réponse à la déplétion en phosphate (Llamas et al., 2009; Quesada et al., 2016 ; Introduction/Chapitre 4.1). Les systèmes CSS jouent un rôle important dans la régulation transcriptionnelle et sont généralement composés de 3 partenaires (un récepteur de la membrane externe, un facteur anti- sigma et un facteur sigma), qui détectent un signal extracellulaire pour le transmettre au niveau cytoplasmique (Llamas et al., 2014). Plus récemment décrit, le σ ECF SigX répond au stress de l’enveloppe cellulaire et est impliqué dans la modulation de la virulence bactérienne, en régulant par exemple la synthèse l’exotoxine A et de la pyocyanine (Gicquel et al., 2013; Chevalier et al., 2018). D’autres facteurs sigma alternatifs impliqués dans le contrôle de la virulence existent chez P. aeruginosa, comme RpoN (σ54_{) qui régule notamment la formation du flagelle et des T4P, ou}

RpoS (σ38_{) qui est actif en phase stationnaire de croissance et le régulateur majeur de la réponse}

au stress (Potvin et al., 2008). Ce dernier contrôle entre autres la synthèse des régulateurs transcriptionnels du Quorum Sensing (QS) LasR et RhlR.

b. Les facteurs de transcription

Les facteurs de transcription (FT) sont des protéines capables de se lier à des séquences d’ADN spécifiques pour activer et/ou inhiber la transcription de gènes (Browning and Busby, 2016). Généralement, les FT activateurs facilitent le recrutement de l’ARN polymérase en se liant en amont des boites promotrices ou près de la boite -35. A l’inverse, une grande majorité des FT répresseurs empêchent l’accès de l’ARN polymérase au promoteur en créant un encombrement

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stérique par leur fixation sur les boites promotrices ou en formant une boucle d’ADN lorsque deux facteurs se fixent à deux sites distants.

Le génome de P. aeruginosa PAO1 code pour 419 FT (www.p2tf.org ; Ortet et al., 2012), classés en différentes familles sur la base des identités de domaines protéiques. Les deux familles les plus représentées sont LysR et AraC/XylS, regroupant 50% des FT de PAO1. La famille de FT LysR est extrêmement conservée et très répandue chez les bactéries (Maddocks and Oyston, 2008). Ses membres possèdent un domaine N-terminal conservé de liaison à l’ADN, avec un motif « Hélice-Tour-Hélice » (HTH) d’environ 60 résidus, et un domaine C-terminal d’interaction avec un co-inducteur, qui est souvent un produit ou un intermédiaire de voies métaboliques. Les facteurs de type LysR sont des « régulateurs doubles » pouvant être à la fois activateurs et répresseurs de la transcription de gènes impliqués dans des fonctions très variées, comme le métabolisme, la motilité, la détoxification ou la virulence. P. aeruginosa possède plus de 100 FT de type LysR, dont PqsR et AmpR (Reen et al., 2013). La famille AraC/XylS est composée d’un grand nombre de FT, principalement impliqués dans l’activation du métabolisme et de la virulence (Gallegos et al., 1997; Ibarra et al., 2008). Ces FT sont présents chez divers genres bactériens et ont une structure comprenant un domaine de liaison à l’ADN C-terminale conservé possédant deux motifs HTH et généralement un ou plusieurs domaines N-terminaux non conservés. Un exemple de FT de la famille AraC/XylS chez P. aeruginosa est le régulateur ExsA, qui est le principal activateur contrôlant la transcription des gènes codant pour le SST3 (Hovey and Frank, 1995; Yahr and Frank, 1994). Finalement, les FT de type LuxR sont moins nombreux chez P. aeruginosa mais également importants pour la virulence bactérienne puisqu’ils font partie du QS(Chen and Xie, 2011; Introduction/Chapitre 3.2.b). Ces régulateurs ont besoin d’interagir avec un co-inducteur de type acyl-homosérine lactones pour réguler la transcription de leurs cibles. Ils possèdent deux domaines conservés : un domaine de liaison à l’ADN en C-terminal et un domaine d’interaction avec le co-inducteur en N-terminal. Chez P. aeruginosa PAO1, 13 gènes codent pour des facteurs de type LuxR, dont quatres sont caractérisés : LasR, RhlR, QscR et VqsR (www.p2tf.org ; Lee and Zhang, 2015).

c. Les systèmes de régulation à deux composants

Les systèmes de régulation à deux composants (TCS, two component systems) permettent de détecter et transmettre un signal généralement environnemental afin d’induire une réponse adaptée (Jung et al., 2012; Balasubramanian et al., 2013). Un TCS simple est composé d’une histidine kinase (HK) « senseur », généralement localisée dans la membrane interne et agissant en dimère, et d’un régulateur de réponse (RR) cytoplasmique. La transduction du signal entre les deux partenaires se fait par un mécanisme de transfert de phosphate (Fig. 17). La détection d’un stimulus par le domaine « input » de l’HK induit l’autophosphorylation d’un résidu histidine (H)

Introduction

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conservé sur le domaine « transmetteur ». Ce groupe phosphoryle est ensuite transféré sur un résidu aspartate (D) conservé du domaine « receveur » (REC) du RR, ce qui induit un changement conformationnel activant le domaine fonctionnel « output » de cette protéine qui est généralement un domaine de liaison à l’ADN (Jung et al., 2012; Balasubramanian et al., 2013). Pour certains systèmes, la transduction du signal entre les deux partenaires nécessite un phosphorelay complexe. En effet, les HK hybrides et non orthodoxes contiennent, en plus d’un domaine « transmetteur », un domaine REC C-terminal (Fig. 17). Un domaine Histidine-phosphotransfert (Hpt) intermédiaire est donc nécessaire pour phosphoryler le domaine REC du RR : il est soit intégré sur les HK non orthodoxes soit présent sur une protéine indépendante (Fig. 17 ; Balasubramanian et al., 2013 ; Jung et al., 2012). Un autre niveau de complexité est apporté aux TCS lorsque plusieurs HK ou plusieurs RR collaborent au sein d’un même système. Ces complexifications des TCS permettent à la bactérie de détecter et d’intégrer de multiples signaux au sein d’un même système de régulation afin d’avoir un meilleur contrôle de son comportement en réponse à l’environnement.

Avec environ 127 protéines impliquées dans un TCS, ces systèmes sont particulièrement représentés chez P. aeruginosa, en comparaison notamment des 60 protéines codées par le génome d’E. coli, et plus de 50% d’entre eux sont en lien avec la régulation de la virulence (Balasubramanian et al., 2013; Francis et al., 2017). Le système GacS/GacA est l’un des TCS les plus importants impliqués dans la transition aiguë/chronique chez P. aeruginosa ; il sera décrit dans la 2e _{partie de ce chapitre (Introduction/Chapitre 3.2.a). Le TCS FimS/AlgR (aussi connu sous}

le nom AlgZ/AlgR) joue également un rôle notable en modulant, entre autres, la motilité bactérienne : le RR AlgR activé par l’HK FimS se lie à la région promotrice de l’opéron

Figure 17 : Organisation structurale des partenaires de TCS.

Représentation schématique des domaines des HK et des RR. L’activation du RR par transfert de groupe phosphoryle peut se faire en une ou plusieurs étapes, selon le type d’HK. H : histidine conservée des domaines « transmetteurs », D : aspartate conservé des domaines

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fimUpilVWXY1Y2E afin d’induire la transcription des gènes et permettre l’assemblage du T4aP

(Lizewski et al., 2002; Belete et al., 2008; Okkotsu et al., 2013, 2014; Kong et al., 2015). Deux TCS jouent un rôle majeur dans l’activation de la synthèse des deux messagers secondaires AMPc et di-GMPc, régulateurs globaux de la virulence de P. aeruginosa. L’HK ChpA et le RR PilG forment un TCS important pour la transduction du signal par le système Pil/Chp et permettent ainsi l’activation de la synthèse d’AMPc par CyaB (Persat et al., 2015; Inclan et al., 2016 ;

Introduction/Chapitre 3.2.c.i). En parallèle, le système de type chimiosensoriel Wsp permet de contrôler la production de di-GMPc grâce au TCS WspE/WspR/WspF. Le transfert du phosphate de l’HK WspE à la DGC WspR induit la synthèse de di-GMPc alors que le RR WspF phosphorylé permet un rétrocontrôle négatif du système (Hickman et al., 2005; Güvener and Harwood, 2007; O’Connor et al., 2012 ; Introduction/Chapitre 3.2.c.ii).

d. Les petits ARN régulateurs

Les petits ARN régulateurs bactériens (50 à 400 nucléotides, ARN) sont des ARN non- codants qui jouent le rôle de régulateurs post-transcriptionnels (Dutta and Srivastava, 2018). Généralement, ils agissent en s’hybridant sur leur(s) ARNm cible(s) afin de moduler négativement leur stabilité ou leur traduction (Sonnleitner et al., 2012; Dutta and Srivastava, 2018). Ils peuvent également avoir un rôle positif, comme le petit ARN PhrS qui régule la synthèse de PQS et de pyocyanine en empêchant la formation d’une structure qui inhibe la traduction de l’ARNm codant pour le régulateur transcriptionnel PqsR (Sonnleitner et al., 2011 ; Intoduction/Chapitre 3.2.c). Dans certains cas, les petits ARN régulateurs interagissent avec des régulateurs protéiques post- transcriptionnels afin de les séquestrer : cela est le cas chez P. aeruginosa des ARN RsmY, RsmZ, RsmW et RsmV (Sonnleitner et al., 2012 ; Introduction/Chapitre 3.2.a). La protéine chaperonne Hfq, qui contrôle la stabilité et la traduction de certains ARNm, peut également intervenir pour moduler la stabilité des petits ARN régulateurs et faciliter leur interaction avec une cible (Vogel and Luisi, 2011; Pita et al., 2018).

Alors que 233 et 573 petits ARN régulateurs ont été identifiés chez PA14 et PAO1 respectivement (dont au moins 126 communs aux deux souches), seuls 14 d’entre eux ont été caractérisés (Pita et al., 2018).