Les monocytes : définition, choix et préparation

Les monocytes sont des cellules animales, plus précisément de mammifères, qui se trouvent dans le sang. Ce sont des globules blancs ou leucocytesa qui jouent un rôle très important au sein du système immunitaire. Produits par des tissus contenus dans la moelle osseuseb, les monocytes participent, via la phagocytosec, à la protection contre l’invasion d’organismes extérieurs tels les virus et les bactéries. Par ailleurs, l’adhésion des monocytes est un acteur principal dans le développement de l’athérosclérose.120

La figure 4.1(a) montre une image de monocytes adhérents sur un biomatériau de verre obtenue par microscopie électronique à balayage. La forme sphérique simple de ces cellules, très

a. Les leucocytes sont les cellules du système immunitaire.

b. Les monoblastes sont les cellules à la base de la formation de ces tissus.

c. La phagocytose est un processus cellulaire à travers lequel une cellule immunitaire détruit les corps extérieurs et les débris cellulaires. Elle se caractérise par la capacité de la cellule à « dévorer » ces corps en adhérant autour d’eux et en les fragmentant.

Chapitre 4. Impédance acoustique d’une cellule animale modèle et contact non spécifique avec un substrat métallique

5 µm

(a) (b)

Ti

Monocyte

Al

O

300 nm

1 mm

x

z

Fig. 4.1 – (a) Photographie de monocytes cultivés sur du SiO2 obtenue par microscopie électro-nique à balayage. (b) Géométrie de l’échantillon utilisé.

proche de celle des capsules biomimétiques étudiées dans la première partie de ce mémoire, est l’une des principales raisons du choix de ce type cellulaire. De plus, le diamètre d’un monocyte, compris entre 14 et 20 µm,121plus petit que celui des cellules étudiées dans les chapitres suivants, nous permet de réaliser un échantillonnage spatial en un temps relativement court avec les techniques d’acoustique picoseconde conventionnellesd. Ajoutons à cela que la cellule est un matériau fortement dissipatif où l’atténuation est typiquement de l’ordre de 1 µm 1.15 Par conséquent, l’épaisseur des monocytes, bien supérieure à 1 µm, permet a priori de considérer ces cellules comme un milieu semi-infini suivant la direction de propagation des ondes acoustiques ⌥_z (Fig.4.1(b)). D’autre part, il a été montré par microscopie à fluorescence que l’adhésion des monocytes est homogène.122 La zone d’adhésion, homogène sur toute la surface de la cellule, permettra de valider la capacité de la technique opto-acoustique à sonder le contact entre une cellule et un biomatériau, avant de passer à l’étude de structures d’adhésion plus complexes.

L’enjeu dans l’application de l’acoustique picoseconde à l’étude de cellules biologiques est d’obtenir le plus d’informations possible sur ces milieux sans les endommager. Pour cette raison, un nouveau biotransducteur permettant de réduire considérablement la di⌫usion thermique dans la cellule et de diminuer le stress cellulaire induit par les lasers a été développé par l’équipe Ul-trasons Laser.123 Il est composé d’un film mince de titane biocompatible, d’épaisseur e = 300 ± 5 nm, déposé par PVD (Physical Vapor Deposition) sur un substrat de saphir (0001) d’épaisseur 1 mm. La transparence du saphir o⌫re la possibilité de focaliser le faisceau pompe à l’interface saphir-titane avec un objectif 60x (N.A 0.7). Cela permet de contenir la di⌫usion de la chaleur, d. Nous utiliserons ultérieurement un dispositif d’acoustique picoseconde permettant de réduire d’un facteur 100 le temps d’acquisition.

4.1 Echantillon et oscillations Brillouin dans les monocytes

l’échau⌫ement des électrons à t = 0, ainsi que l’exposition de la cellule au rayonnement de la pompe car la pénétration optique dans le titane est de 15 nm, bien inférieure à l’épaisseur du film. La fréquence de modulation du laser a été choisie égale à 1 MHz de manière à éviter un confine-ment thermique dans le transducteur de titane.124 La rugosité de la surface de titane, d’environ 10 nm, a été caractérisée par profilométrie optique. La géométrie de l’échantillon est représentée dans la figure 4.1(b). La culture des monocytes sur le biomatériau est assurée par l’équipe du laboratoire CBMN, UMR CNRS 5248, coordonnée par M.-C. Durrieu. Les monocytes, dérivant d’une lignée cellulairee, sont cultivés sur le titane et fixés par de la paraformaldehyde. Notons qu’il s’agit d’une fixation chimique et non pas mécanique. Cette technique de fixation permet de manipuler les cellules à l’air libre sans les dégrader et garantie qu’elles ne changeront pas de propriétés durant l’expérience.41

Étant constitué d’un film mince, ce transducteur permet de se placer dans deux configurations supplémentaires à la configuration classique utilisant un transducteur épais, présenté dans la première partie de ce manuscrit. En focalisant la sonde par le dessus, à l’interface cellule-titane avec un objectif 50x (N.A 0.8), on est capable de détecter les oscillations Brillouin dans la cellule et par suite d’obtenir la vitesse des ondes acoustiques : la configuration est dite bi-latérale (Fig.

4.2(a)). D’autre part, afin de déterminer séparément le coe⇠cient de réflexion, une deuxième configuration est possible : la configuration dite uni-latérale inférieure. Dans ce cas les deux faisceaux pompe et sonde sont focalisés du même côté, à l’interface saphir-titane (Fig.4.3)(a). Il faut souligner qu’en se plaçant dans cette configuration, aucun laser n’est visible sur la caméra du microscope, ce qui empêche la localisation des faisceaux sur l’échantillon. Pour s’a⌫ranchir de ce problème, il est nécessaire de se placer dans la configuration bi-latérale et de s’assurer, en détectant les oscillations Brillouin dans la cellule, que la pompe focalisée de dessous est parfaitement alignée avec la sonde focalisée de dessus. Une fois que la position de la pompe sur la cellule est ainsi repérée, on peut maintenant focaliser la sonde du même côté que la pompe. Ainsi, ce nouveau biotransducteur ouvre de nouvelles voies pour caractériser les milieux cellulaires en o⌫rant la possibilité de mesurer à la fois la vitesse des ondes acoustiques dans la cellule à travers les oscillations Brillouin, son impédance acoustique et la qualité d’interface via le coe⇠cient de réflexion acoustique. C’est une démarche complète qui fera l’objet de la suite de ce chapitre.

Chapitre 4. Impédance acoustique d’une cellule animale modèle et contact non spécifique avec un substrat métallique

(a) (b)

Temps (ns)

V

ar

ia

tio

n d

e l

a r

éfl

ec

tiv

ité

(

x1

0 )

0 0.1 0.2 0.3

0.04

0.08

0.06

0.1

0 20 40 60 80

Fréquence (Ghz)

0

0.5

1

lTFl

(

u.a

)

Ti

Monocyte

300 nm

1 mm

Pompe

x60

x50 Sonde

x

z

Al

O

Fig. 4.2 – (a) Configuration bi-latérale pour la mesure de la célérité acoustique : la pompe est focalisée par le dessous à l’interface saphir-titane et la sonde par le dessus à l’interface cellule-titane. (b) Variation de la réflectivité en fonction du temps dans le cas de la configuration bi-latérale et spectre de Fourier associé (encart).