3.2.1 Le prélèvement de moelle osseuse
Le prélèvement allogénique des cellules souches hématopoïétiques de la moelle osseuse est réservé aux médecins de centres d’hématologie-greffe. Il doit donc être réalisé dans un CHU habilité. Il en existe 36, répartis dans toute la France.
37 Ce prélèvement n’est réalisé que si des conditions bien strictes sont remplies. L’aptitude du donneur doit être vérifiée et validée par les hématologues et anesthésistes : D’une manière générale, il ne doit pas être porteur d’une infection virale, d’une maladie cancéreuse, d’une maladie auto-immune ou tout autre pathologie nécessitant un traitement chronique et ne doit pas présenter de contre -indication à une anesthésie générale. C’est un principe de précaution qui protège à la fois le receveur et le donneur. Dans la grande majorité des cas, la date de prélèvement coïncide avec la date de greffe pour éviter les pertes cellulaires associées aux étapes de congélation/décongélation.
Dans un souci d’asepsie, le prélèvement est réalisé au bloc opératoire par deux hématologues, sous anesthésie générale, au niveau des crêtes iliaques postérieures qui sont riches en moelle, le patient étant en décubitus ventral. Cette voie à l’avantage de ne pas être à proximité d’organes vitaux. L’intervention est rapide, et dure entre 1h00 et 1h30.
D’autres sites de prélèvement existent. Chez les enfants de moins de 5 ans, la ponction peut être réalisée au niveau des crêtes tibiales antérieures et chez les enfants plus âgés, elle peut être réalisée au niveau des crêtes iliaques antérieures et du sternum.
Pour ponctionner, l’hématologue utilise des trocarts dotés d’orifices latéraux permettant d’aspirer la moelle osseuse à différents endroits en changeant la position du trocart entre chaque aspiration de 5 à 10mL de moelle osseuse.
La quantité de moelle osseuse aspirée dépend du poids du donneur et du receveur. Elle est d’une manière générale, d’un maximum de 20mL/kg de poids du donneur, dans le but d’obtenir environ 2 à 3 x 108 cellules nucléées par kg de poids du receveur. Pour atteindre le volume désiré, il est plus
intéressant d’effectuer plusieurs petites aspirations afin d’éviter la dilution de la moelle osseuse par le sang périphérique. Ainsi, on effectue 5 à 10 ponctions qui permettent au final de réaliser 100 à 200 aspirations. La moelle osseuse recueillie est ensuite placée dans une poche adaptée contenant un mélange sérum salé isotonique et anticoagulant. Il sera ensuite filtré pour éliminer les particules osseuses et graisseuses.
3.2.2 Le prélèvement de cellules souches périphériques (CSP)
Les greffons sanguins représentent la source la plus utilisée de cellules souches hématopoïétiques allogéniques. Contrairement au prélèvement de moelle osseuse, les cellules souches du sang périphériques peuvent être recueillies dans un établissement français du sang ou dans un service hospitalier spécialisé.
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3.2.2.1 Le principe
Chez l’individu sain, il est établi que des progéniteurs hématopoïétiques circulent librement dans le sang mais à un taux très faible de l’ordre de 1 à 2% de ce qui e st retrouvé dans la moelle osseuse, ne permettant pas de collecter assez de cellules pour constituer un greffon intéressant. Pour augmenter ce nombre et pouvoir envisager la réalisation d’un greffon par aphérèse, il est nécessaire de réaliser au préalable une mobilisation des cellules souches hématopoïétiques grâce à l’administration d’un facteur de croissance G-CSF (granulocyte colony stimulating factor).
Tout comme pour le don de moelle osseuse, il est important de vérifier l’aptitude du donneur, et notamment de vérifier qu’il ne présente pas de contre-indication à l’utilisation du facteur de croissance ou à la réalisation de la cytaphérèse.
3.2.2.2 Les facteurs de croissance G-CSF, Filgrastim (NEUPOGEN®) et Lénograstim (GRANOCYTE®)
Le G-CSH est commercialisé sous deux formes : Le filgrastim, molécule non glycosylée produite par recombinaison génétique dans Escherichia coli et le lenograstim, molécule glycosylée produite par recombinaison génétique dans les cellules d’ovaire de hamster chinois (CHO). L’objectif du traitement est de stimuler la production de cellules souches hématopoïétiques et de les faire passer de la moelle osseuse vers le flux sanguin. Pour cela, il est nécessaire de réunir deux conditions 66 :
- d’une part, la rupture de l’interaction avec la niche hématopoïétique ;
- d’autre part, le franchissement des cellules endothéliales des sinusoïdes médullaires pour rejoindre le flux sanguin.
Pour cela, le rôle de la chimiokine SDF-1 et de son ligand CXCR4 a été largement documenté au cours des dernières années. Les progéniteurs hématopoïétiques expriment à leur surface le récepteur CXCR4 et les cellules du microenvironnement médullaire (ostéoblastes et cellules endothéliales) sécrètent SDF-1. Leur interaction est responsable de la rétention des cellules souches hématopoïétiques au sein du micro-environnement médullaire 67.
Lors de l’administration de G-CSF, les précurseurs neutrophiles s’accumulent dans la moelle osseuse et les protéases (elastase et cathepsine G) qu’ils libèrent exercent une activité protéolytique sur SDF- 1 et son récepteur CXCR-4 d’où une diminution de l’attraction des cellules CD34+ par le microenvironnement médullaire 68 (Figure 17). Par ailleurs ces protéases pourraient cliver d’autres
39 le G-CSF diminuerait l’expression d’ARNm codant pour le SDF-1 et inhiberait l’action ostéoblastique, d’où une diminution des taux de SDF-1 70.
Le G-CSF permet, lors de la mobilisation, de recueillir un greffon qui contient à la fois des progéniteurs matures et des progéniteurs plus primitifs qui permettraient d’assurer une hématopoïèse efficace sur le long terme. Il est prescrit à la posologie de 10µg/kg/jour, le plus souvent en deux doses journalières car c’est ainsi qu’il est le plus efficace et par voie sous-cutanée pendant 5 jours à la suite desquels le prélèvement par cytaphérèse sera effectué.
3.2.2.3 La cytaphérèse
La cytaphérèse est une technique qui permet de séparer les cellules sanguines par centrifugation extracorporelle dans le but de collecter les cellules souches hématopoïétiques circulantes. Ceci est possible puisque les différents types de cellules présents dans le sang n’ont pas la même densité. En général, une seule cytaphérèse est nécessaire pour collecter suffisamment de cellules. Elle dure entre 3 et 5 heures et ne nécessite pas d’anesthésie. Un accès veineux est fait sur les veines périphériques des bras (veines cubitales antérieures) : il permet, sur l’un d’eux, de prélever le sang à
40 un débit d’environ 60mL/minute et de l’envoyer à l’appareil, et sur l’autre bras, de restituer le sang après séparation des cellules souches.
Le sang du donneur suit donc une circulation extra-corporelle. Pour éviter que le circuit ne se bouche, un anticoagulant (citrate) est utilisé. Son retour dans la circulation du donneur peut être à l’origine d’une hypocalcémie dont les symptômes sont des étourdissements, des picotements de la bouche, des mains et des pieds. Un apport de calcium au donneur peut éviter ces désagréments.
3.2.3 Le prélèvement de sang de cordon
En France, les unités de sang placentaire sont collectées dans un réseau de 27 maternités autorisées par l’ARS (agence régionale de santé) et réparties sur l’ensemble du territoire. Elles sont rattachées à 5 banques publiques de sang placentaire affiliées au Réseau Français de Sang Placentaire RFSP. L’activité de prélèvement d’unités placentaires a ralenti du fait du resserrement du RFSP. En effet avant 2015, on comptait 11 banques de sang placentaires et plus de 70 maternités 6. Au 31 Décembre 2015,
on comptait 34 115 USP dans le réseau français de sang placentaire et 744 000 USP dans l’ensemble des banques internationales (Figure 18).
Figure 18 : Evolution du nombre d'unités placentaire en France 6
Le don de sang placentaire est un don anonyme, gratuit et pour autrui conformément à la loi n°2001- 814 du 7 Juillet 2011 relative à la bioéthique.
Là encore, toutes les femmes ne peuvent pas donner (Annexe 6) car il existe des critères stricts de sélection établis par le réseau français de sang placentaire afin d’assurer un produit cellulaire le plus sûr possible. Ils sont validés lors d’un entretien médical mené par un médecin ou une sage -femme de
41 la maternité. La donneuse signe son consentement éclairé, révocable sans forme et à tout moment tant que le prélèvement n’est pas effectué.
Le prélèvement est réalisé en salle de naissance, après clampage précoce et section du cordon ombilical 71 par une ponction dans la veine ombilicale. Il s’agit d’un geste anodin pour l’enfant et la
mère. Cependant, en cas de nécessité de prise en charge médicale de la maman ou son nouveau-né, le prélèvement peut être annulé.
Après sa réalisation, le don est étiqueté et conservé au maximum 24 heures dans la maternité avant d’être envoyé à la banque de sang placentaire. Après la naissance de l’enfant, 2 qualifications post- natales seront réalisées pour s’assurer de sa bonne santé. La première a lieu 2 à 3 jours après la naissance par un pédiatre de la maternité. La seconde a lieu 6 semaines après la naissance par le médecin qui suit l’enfant. Cette dernière sera envoyée à la banque.
Une fois à la banque, une réduction de volume de l’unité de sang placentaire est réalisée. Elle permet de diminuer le volume de plasma et de globules rouges résiduels. Le volume de produit final après addition du cryoprotecteur (DMSO/Dextran) est de 25mL 72. Cette étape facilite la conservation en
azote liquide ou gazeux en limitant les espaces de stockage. A savoir que les USP ne sont conservées que si elles répondent à deux critères : Une richesse en cellules nucléées > 160x107 (contre 140x107 en
2014) et une richesse en CSH CD34+ > 1,8x106. Ces deux critères font que sur les 15 404 prélèvements
de sang placentaires réalisés par les maternités en 2015, seuls 8% étaient conformes, d’où un réel besoin d’optimiser la qualité de prélèvement des unités 6