Les microscopies à fluorescence

2.4.1 Origines de la fluorescence

L’absorption d’une onde électromagnétique par une molécule est soumis aux règles de la mécanique quantique. Pour qu’un photon d’énergie hν soit absorbé, il faut que cette énergie corresponde au minimum à la différence d’énergie entre le niveau électronique de plus basse énergie et celui des niveaux excités de plus haute énergie. De plus, pour que cette transition soit possible, il est nécessaire que la multiplicité des états soit compatible à savoir une transition de type singulet – singulet (S0 → Sn). Après excitation, la molécule se désactive suivant des processus radiatifs et non radiatifs. Les processus non radiatifs correspondent aux mécanismes de relaxation non associés à une émission de photon tel la relaxation vibrationnelle, la conversion inter-système singulet – triplet, le transfert d’électron, la séparation de charges, et la réaction chimique. Les processus radiatifs correspondent au retour de l’électron excité S1 à son niveau fondamental S0 par émission d’un photon d’énergie égale à la différence d’énergie entre le niveau excité et le niveau fondamental.

Les transitions électroniques entre niveaux de multiplicités différentes sont interdites par les règles de la mécanique quantique, ce qui signifie qu’expérimentalement elles sont très peu accessibles. Les phénomènes de fluorescence sont donc des mécanismes rapides (quelques picosecondes à quelques nanosecondes). Les processus de fluorescence à partir de niveaux électroniques autres que S1 (premier niveau électronique excité) sont extrêmement rares et donc de faible intensité. Si la molécule est excitée à un niveau électronique supérieur, elle relaxe généralement par un mode vibrationnel pour atteindre le niveau S1.

Le couplage des méthodes d’analyse de la fluorescence aux techniques de microscopie est couramment utilisé en biologie.16 Les techniques de fluorescence permettent aussi bien l’observation de particules ou structures métaboliques par marquage direct16 que la mise en évidence de processus biologiques en utilisant des procédés de révélation ou d’extinction de fluorescence.17, 18 On compte à l’heure actuelle de nombreuses techniques de microscopie à fluorescence. Nous nous limiterons à décrire celles qui ont été utilisées dans le cadre de ce travail, c'est-à-dire la microscopie confocale et la microscopie à épifluorescence.

En microscopie à fluorescence, la source lumineuse est placée sous l’échantillon à analyser ce qui limite son champ d’utilisation aux échantillons très minces. Pour pouvoir observer des échantillons plus épais, le faisceau d’excitation percute l’échantillon par le dessus en passant par l’objectif (voir Figure 2.6). La séparation du faisceau excitant incident du faisceau émis se fait à l’aide d’un miroir dichroïque.

La microscopie confocale utilise les mêmes principes que la microscopie à épifluorescence. La source lumineuse d’excitation est un faisceau laser pulsé focalisé sur un premier filtre spatial (voir Figure 2.6). Ce filtre a pour but de définir avec précision la position du point de la source d’excitation. L’émission de fluorescence de l’échantillon collectée par l’objectif est focalisée sur le trou confocale placé devant le détecteur. Le détecteur sélectionne les photons provenant uniquement du plan focal de l’objectif. Les photons émis avant ou après le plan focal sont éliminés par le filtre spatial. L’émission de fluorescence est alors spatialement localisée au sein de l’échantillon. Un système de déplacement fin permet de mesurer l’émission de fluorescence sur différents plans XY et à différentes profondeurs Z de l’échantillon. La résolution latérale de ces techniques est de l’ordre de la longueur d’onde de la lumière utilisée pour illuminer l’échantillon, autrement dit de l’ordre de la centaine de nanomètre ce qui limite sont usage à des systèmes de tailles micrométriques comme des cellules.

Figure 2.5 : Schéma de principe des trois types de microscopies : (a) microscopie optique ; (b) microscopie à épifluorescence et (c) microscopie confocale

2.5 Références

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5. Heuberger, M.; Luengo, G.; Israelachvili, J., Topographic information from multiple beam interferometry in the surface forces apparatus. Langmuir 1997, 13, (14), 3839-3848.

6. Tolansky, S., Multiple Beam Interferometry of Surfaces and Films. Oxford University Press: 1948. source source échantillon objectif miroir Détecteur

(a) Microscope (b) Microscope a épifluorescence

source Filtre X Y Z miroir Trou échantillon objectif Détecteur (c) Microscope confocal

7. Israelachvili, J. N., J. Colloid Interface Sci. 1973, 44, 259.

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