Les faibles modifications de propriétés physico-chimiques de

l’ovotransferrine par chauffage à sec induisent un changement de grande

ampleur de son comportement interfacial

La propriété de l’Otf à s’adsorber à l’interface liquide/air est amplement accrue, avec les

faibles modifications, apportées à la protéine, suite au chauffage à sec. Le DH-Otf de structure

probablement moins flexible (voir § III.3.1), se caractérise par un Γ

1,21 mg/m² alors qu’elle est

de 1,13 mg/m² pour N-Otf, ce qui équivaut à une concentration surfacique 7% plus élevée pour

DH-Otf. Autrement dit, et dans la supposition que les deux protéines forment un réseau hexagonal

à l’interface, pour entamer des forces de cohésion, la distance moyenne entre les molécules

d’ovotransferrine adsorbées passe de 8,1 nm pour le N-Otf à 7,85 nm pour le DH-Otf, c’est-à-dire

que le chauffage à sec permet de réduire cette distance moyenne de 2,5 Å. Par ailleurs, la

compressibilité de l’Otf qui est faible à l’origine, reste identique après chauffage à sec avec

Θ = 5,0 mN.m/mg. L’évolution des forces latérale, durant la densification de la monocouche

protéique, est désormais faible. Le comportement identique, à l’augmentation de la densité de la

monocouche, pour les deux formes d’Otf, peut être un témoin de propriétés structurales proches,

qui sont relativement conserver après chauffage à sec.

La capacité d’adsorption et l’affinité de l’Otf à l’interface air/liquide sont considérablement

modifiées après chauffage à sec de la protéine. A des faibles concentrations inférieures à 0,015 µM,

le chauffage à sec abaisse la capacité d’adsorption de l’Otf à l’interface liquide/air. La répulsion

électrostatique de l’interface air/liquide induite par l’augmentation de la charge globale de l’Otf,

après le chauffage à sec, est responsable de ce comportement à faibles concentrations. Ceci favorise

la demeure du DH-Otf à l’état dissous ce qui abaisse sa capacité d’adsorption à l’interface avec

l’air. A des concentrations supérieures à 0,015 µM, la capacité d’adsorption du DH-Otf est

amplement accrue par rapport au N-Otf. L’augmentation de l’hydrophobie de surface de

l’ovotransferrine après chauffage à sec augmente son adsorption à l’interface liquide/air pour les

mêmes concentrations en sous-phase.

Cela est expliqué par le fait que l’affinité de l’Otf à l’interface liquide/air, qui est une

interface hydrophile/hydrophobe, dépend essentiellement de l’hydrophobie de surface et de sa

charge globale. A faibles concentrations, la charge globale plus élevée, affaiblie la capacité de la

protéine à s’adsorber à l’interface qui est neutre. Pour cela, à faibles concentrations, DH-Otf

s’adsorbe moins à l’interface liquide/air que N-Otf. A fortes concentrations, l’adsorption plus

importante de DH-Otf est due à son hydrophobie de surface qui est plus élevée. En effet, étant

donné que l’Otf est dissoute dans un milieu polaire, composé de molécules d’eau, l’augmentation

de l’hydrophobie de surface fait augmenter le potentiel chimique de la protéine en solution et le

diminuer à l’interface avec l’air. Cela entraine plus le déplacement de l’équilibre de l’Otf de l’état

dissous à l’état adsorbé à l’interface avec l’air. Alors, sauf pour les faibles concentrations, le

chauffage à sec améliore l’adsorption de l’Otf à l’interface. A titre d’exemple, il ne faut que 0,1 µM

ailleurs, les deux formes de l’ovotransferrine atteignent une adsorption maximale identique

d’environ 17 mN/m. La forme chauffée atteint cette adsorption maximale à une concentration plus

faible à 1 µM alors qu’elle est de 3,5 µM pour la forme native. Bien qu’elle soit atteinte à des

concentrations différentes, à cause de l’affinité différentes à l’interface, l’adsorption maximale des

deux formes d’ovotransferrine est identique en raison de leurs compressibilités similaires. Cette

pression de surface maximale est donc une limite qui s’oppose à l’insertion de nouvelles protéines

dans la couche protéique déjà formée en contact avec l’air.

Dans la littérature, l’adsorption de l’Otf à l’interface liquide/air est sensible aux conditions

physico-chimiques, qui peut former une monocouche ou une multicouche [201]. Dans les

conditions expérimentales qu’on a choisies, La forme native de l’ovotransferrine forme, un film

composé d’une couche unique de protéines à l’interface avec l’air. Au cours de la cinétique

d’adsorption de l’ovotransferrine suivi par ellipsométrie, la concentration de surface augmente,

jusqu’à parvenir à une valeur d’équilibre. Cette valeur d’équilibre est concentration-dépendante,

plus la concentration en sous-phase est importante plus la concentration de surface à l’équilibre est

élevée jusqu’à atteindre une valeur maximale. Les angles de décalage ellipsométrique

correspondent à la formation d’une monocouche qui se densifie, faisant augmenter la pression de

surface. Cette densification est interprété par Graham et Phillips comme étant la pénétration de

protéines dans une interface occupée, c’est-à-dire de nouvelles protéines viennent s’insérer entre

d’autres préalablement adsorbées [199, 202]. A la saturation de l’interface (14,7° – 2,94 mg/m²),

l’augmentation de la concentration en sous-phase est sans effet à cause de l’encombrement stérique

des protéines et à l’interface où la monocouche d’ovotransferrine est la plus dense possible. Dans

cette situation de densité maximale, l’ovotransferrine occupe une aire à l’interface de

44,9 nm²/molécule soit une distance de 7,1 nm entre les protéines adsorbées.

Dans cette étude, on a montré qu’aux mêmes conditions physico-chimiques, le

comportement de l’Otf à l’interface est sensible aux faibles modifications de propriétés engendrées

par le chauffage à sec. Le comportement interfacial des molécules de DH-Otf dépend de la

concentration qui conditionne l’état du film protéique formé. Contrairement à l’Otf native qui

forme toujours une monocouche, la forme chauffée forme une monocouche aux faibles

concentrations (< 0,1 µM) et évolue vers la formation d’une bicouche aux concentrations

supérieures. Desfougeres et al. ont montré que le comportement du lysozyme à l’interface est aussi

modifié après chauffage à sec. Tandis que la forme native du lysozyme forme une monocouche, la

forme chauffée s’agrège pour former des multicouches [193]. La première couche, avec les forces

de cohésion inter-protéines, constitue une barrière pour l’accès de nouvelles protéines à l’interface.

Cependant, tant que les forces de cohésion ne dépassent pas l’affinité pour l’interface, l’Otf peut

surmonter ces forces pour arriver à s’adsorber. En parallèle, et d’après les cinétiques d’adsorption

suivies par tensiométrie et par ellipométrie, DH-Otf a une affinité pour la première couche

préformée, amenant à la formation d’une bicouche protéique. Néanmoins, l’affinité de DH-Otf

pour la première couche préformée est moins importante que son affinité pour l’interface avec l’air.

En effet, l’augmentation de la concentration protéique entraine en priorité la densification de la

première couche, tant que l’insertion de DH-Otf nécessite une énergie inférieure à 0,71 aJ. Au-delà

de ce niveau d’énergie, les molécules de DH-Otf ne peuvent plus s’insérer et la première couche

est dans son état le plus dense. Quand l’insertion nécessite plus de 0,64 aJ/protéine, l’affinité des

protéines en solution pour la première couche préformée se traduit par l’adsorption contre celle-ci.

A l’équilibre, où les forces de cohésion sont entre 0,64 et 0,71 aJ/molécule, DH-Otf en solution est

en équilibre avec la forme adsorbée à l’interface d’une part et la forme adsorbée contre la couche

préformée d’autre part. La Figure III-10 illustre le comportement de DH-Otf en fonction de la

concentration, à l’interface liquide/air. Selon Desfougeres et al., l’agrégation du lysozyme chauffé

à sec est attribuée à l’augmentation de l’hydrophobie de surface et de la flexibilité de la structure

[193]. Dans le cas de DH-Otf, l’augmentation de ces deux paramètres n’entraine pas une agrégation

et l’adsorption est limitée à une double couche pour les solutions les plus concentrées.

Figure III-10 : Schéma récapitulatif du comportement de DH-Otf à l’interface liquide/air avec

l’augmentation de la concentration en sous-phase

III.3.5.Influence de l’effet barrière sur l’affinité de l’ovotransferrine native et