Caractérisation physico-chimique de l’ovotransferrine native et chauffée à sec

sec

III.2.1.1. Dimension et hétérogénéité des populations d’ovotransferrine native et

chauffée à sec

Dans l’objectif de déterminer la taille des protéines, des solutions d’Otf native (N-Otf) et

d’Otf chauffée (DH-Otf) ont été analysées par DLS "Dynamic Light Scattering". Les résultats

présentés dans la Figure III-1 montrent la distribution des proportions volumiques en fonction du

diamètre hydrodynamique des molécules de N-Otf et de DH-Otf.

Figure III-1 : Distribution en fonction du diamètre hydrodynamique de N-Otf (—) et de DH-Otf (– ‒)

obtenue par DLS. Les solutions protéiques de N-Otf (11,6 µM) et de DH-Otf (11,4 µM) sont

préparées avec un tampon HEPES (5 mM), NaCl (150 mM) de pH 7.

Le diamètre hydrodynamique est de 6,8 nm pour N-Otf alors qu’il est plus élevé avec

9,4 nm pour DH-Otf. Les dimensions de l’apo-Otf données par Kurokawa et al [167] et qui sont

(5×6×10) nm

³

permettent de calculer un diamètre moyen de 6,8 nm, en assimilant la protéine à un

ellipsoïde. Le diamètre hydrodynamique moyen que nous avons mesuré pour N-Otf est donc en

accord avec celui calculé à partir des données de la littérature. Par ailleurs, la valeur minimale et la

moyenne du diamètre hydrodynamique de DH-Otf sont légèrement supérieures à celles de N-Otf

et de la moyenne du diamètre hydrométrique signifient que la structure de DH-Otf est moins

compacte que N-Otf. La diminution de la compacité de la structure de DH-Otf est probablement

due à la rupture d’un certain nombre de liaisons hydrogène dans N-Otf par le chauffage à sec

aboutissant à une structure d’ovotransferrine moins rigide. L’hétérogénéité plus élevée du diamètre

hydrométrique de DH-Otf est certainement liée en partie à la rupture plus ou moins importante des

liaisons hydrogène d’une molécule à l’autre, mais on pourrait également soupçonner une

agrégation partielle. En effet, la valeur maximale du diamètre hydrodynamique de DH-Otf est le

double de celle de N-Otf (Tableau III-1). Ainsi, nous avons effectué l’analyse de N-Otf et DH-Otf

par HPLC d’exclusion stérique.

Tableau III-1 : Récapitulatif des valeurs moyennes, minimales et maximales de N-Otf et de DH-Otf.

Diamètre hydrodynamique

Valeur minimale (µM) Valeur moyenne (µM) Valeur maximale (µM)

N-Otf 3,6 6,8 18,2

DH-Otf 4,2 9,4 37,8

Figure III-2 : Chromatogramme de N-Otf (—) et de DH-Otf (···) par HPLC d’exclusion stérique. Les

solutions protéiques de N-Otf (11,6 µM) et de DH-Otf (11,4 µM) sont préparées avec un tampon

HEPES (5 mM), NaCl (150 mM) de pH 7. L’élution est faite avec le même tampon sur une

colonne BioSep™ 5 µm SEC-s3000 400 Å (300 × 7.8 mm).

L’analyse par HPLC d’exclusion permet la séparation des protéines selon leur masse

moléculaire apparente [168-171]. Le chromatogramme de N-Otf montre un seul pic fin et

symétrique cohérent avec le caractère monomérique de l’Otf native. Le chromatogramme de

DH-Otf montre en revanche trois pics principaux, correspondant donc à trois populations d’DH-Otf de

masses moléculaires différentes. Le pic majoritaire (56% de l’aire totale), correspondant au pic de

N-Otf, correspond vraisemblablement à la DH-Otf à l’état monomérique. Les autres pics, de masses

moléculaires supérieures correspondraient quant à elles à des états agrégés de DH-Otf, témoins

donc de la formation de multimères. Ce comportement d’agrégation après chauffage a été étudié et

observé pour un très grand nombre de protéines globulaires [172-177]. L’agrégation d’une partie

des molécules d’Otf implique un accroissement des interactions attractives entre les molécules

protéiques après chauffage à sec. Le fait que seule une partie des molécules d’Otf soient agrégées

explique la plus grande hétérogénéité observée pour DH-Otf par rapport à N-Otf (Figure III-1). Par

ailleurs, l’augmentation du rayon hydrodynamique moyen suggère un faible degré de

polymérisation, sous forme essentiellement de dimères ou trimères.

III.2.1.2. Structure moléculaire de l’ovotransferrine native et chauffée à sec

La fluorescence intrinsèque

La mesure de la fluorescence intrinsèque du tryptophane est utilisée pour détecter des

changements locaux de la structure secondaire et/ou tertiaire des protéines. En effet, un changement

du microenvironnement du tryptophane a une incidence sur le spectre de fluorescence de cet acide

aminé. La fluorescence intrinsèque de N-Otf et de DH-Otf a été mesurée après excitation à

λ

excitation

= 295 nm à l’aide d’un spectrofluorimètre (Fulorolog – Jobin Yvon

^®

). Les spectres

d’émission étaient enregistrés de 310 à 450 nm comme le montre la Figure III-3. La mesure

spectrale est répétée deux fois pour chaque protéine.

Figure III-3 : Spectre de la fluorescence intrinsèque de N-Otf (—) et de DH-Otf (– ‒) après excitation à

295 nm. Le spectre d’émission est de 310 à 450 nm. Les solutions protéiques de N-Otf (1,00 µM)

et de DH-Otf (0,91 µM) sont préparées avec un tampon HEPES (5 mM), NaCl (150 mM) de pH

7. Les courbes sont normalisées selon la concentration protéique.

Les spectres d’émission de N-Otf et de DH-Otf sont pratiquement superposables, avec une

fluorescence maximale identique, mesurée à une longueur d’onde de 325 nm (Figure III-3). La

fluorescence intrinsèque est donc identique entre N-Otf et DH-Otf. La fluorescence intrinsèque est

sensible à la polarité du microenvironnement des résidus tryptophane, la superposition des spectres

de fluorescence, signifie qu’aucune modification significative n’est survenue sur les

microenvironnements des résidus tryptophane après chauffage à sec de l’Otf. Néanmoins, il peut y

avoir un phénomène de compensation, qui masque des variations éventuelles dans la structure de

l’Otf globalement et dans le microenvironnement des résidus tryptophane en particulier. En effet,

les liaisons hydrogène établies par les résidus avoisinants, la densité électronique, l’accessibilité

des molécules d’eau sont des paramètres qui modifient la polarité du microenvironnement du

tryptophane, qui peut modifier l’intensité de la fluorescence et un décalage de la fluorescence

maximale [178-182].

La fluorescence extrinsèque

La mesure de la fluorescence extrinsèque est un outil qui permet d’évaluer l’hydrophobie

de la surface des protéines par l’emploi d’une sonde externe [183, 184]. L’ANS (Sigma-Aldrich

®

)

(l-anilinonaphthalene-8-sulphonate) est une sonde apolaire fluorescente utilisée pour ce type de

mesure [185-187]. L’ANS a une grande affinité pour les zones apolaires en surface des protéines.

Et alors que sa fluorescence est faible lorsqu’elle est en solution dans l’eau (polaire), son intensité

de fluorescence augmente fortement lorsqu’elle est dans un environnement apolaire ; sa longueur

d’onde maximale d’émission se déplace également vers des longueurs d’onde plus faibles. A l’aide

d’un spectrofluorimètre (Fulorolog – Jobin Yvon

^®

), les spectres d’émission de fluorescence des

solutions ANS/N-Otf et ANS/DH-Otf, de 420 à 600 nm, sont présentés dans la Figure III-4, pour

une longueur d’onde d’excitation λ

excitation

de 370 nm. La mesure spectrale est répétée deux fois

pour chaque protéine.

Figure III-4 : Spectre d’émission de la sonde ANS en présence de N-Otf (—) et de DH-Otf (– ‒) après

excitation à 370 nm. Le spectre d’émission est de 420 à 600 nm. Les solutions protéiques de

N-Otf (1,00 µM) et de DH-N-Otf (0,91 µM) sont préparées avec un tampon HEPES (5 mM), NaCl

(150 mM) de pH 7.

La longueur d’onde de fluorescence maximale de N-Otf est à λ

max

= 533 nm alors que celle

de DH-Otf est à λ

max

= 511 nm. La bande spectrale de DH-Otf a une intensité de fluorescence

supérieure à celle du N-Otf. L’augmentation d’intensité de fluorescence et le décalage vers le bleu

de λ

max

(de 22 nm) suggère une hydrophobie de surface de DH-Otf plus élevée que N-Otf. En effet,

l’intensité de fluorescence de l’ANS est sensible à la polarité de son environnement et augmente

avec l’augmentation de l’hydrophobicité [188]. Mais étant donné que l’ANS est anionique, cette

sonde est aussi susceptible de s’apparier avec les résidus chargés positivement exposés en surface

et/ou un décalage de la longueur d’onde maximale d’émission vers les valeurs basses peut indiquer

une meilleure accessibilité de la sonde à des résidus enfouis au cœur de la protéine, en raison d’une

flexibilité plus importante [190, 191]. Si les spectres de fluorescence observés pour DH-Otf

suggèrent par conséquent une hydrophobie de surface accrue par rapport à N-Otf, on ne peut pas

exclure totalement que DH-Otf présente également une charge positive de surface plus élevée,

et/ou une structure plus flexible que N-Otf.

Structure secondaire

L’analyse de N-Otf et de DH-Otf, par spectroscopie de dichroïsme circulaire, à l’UV

lointain, devrait permettre la mise en évidence d’un éventuel changement de la structure

secondaire, par effet du chauffage à sec. Les spectres CD des deux formes d’Otf sont présentés

dans la Figure III-5.

Figure III-5 : Analyse par dichroïsme circulaire en l’UV lointain de la structure secondaire de N-Otf (—) et

de DH-Otf (···). Les solutions protéiques de N-Otf (6,08 µM) et de DH-Otf (6,25 µM) sont

préparées avec un tampon HEPES (5 mM), NaCl (150 mM) de pH 7.

Les spectres CD de N-Otf et de DH-Otf sont pratiquement comparables, synonyme de

l’absence de différence dans le contenu en structure secondaires entre les deux formes d’Otf. Le

chauffage à sec est donc un procédé sans impact la structure secondaire de l’Otf.

III.2.2.Caractérisation à l’interface air/liquide de l’ovotransferrine Native et

Dans le document Mécanisme membranotrope de l'ovotransferrine sur membranes modèles de bactéries : impact du chauffage à sec de la protéine (Page 70-76)