Les différents types d’interrogation du plasmon

Les appareils commerciaux peuvent être basés sur trois configurations différentes. Lorsqu’un événement biologique se produit à l’interface métal / diélectrique et, si seule la longueur d’onde est fixée, l’énergie nécessaire pour exciter les plasmons de surface va changer et l’angle de résonance plasmonique va varier (interrogation angulaire), au même titre que la longueur d’onde évoluera si l’on fixe l’angle d’incidence (interrogation spectrale). Dans le cas d’un angle et d’une longueur d’onde fixe, l’intensité lumineuse va augmenter (interrogation en réflectivité) (Fig 25).

A titre d'exemple, l’appareil de BIA3000, commercialisé par BIAcore®, est basé sur l’interrogation angulaire. Comme seule la longueur d’onde est fixe, la mesure des événements à

Fig. 25 : Différentes méthodes exploitant l’évolution des courbes de plasmons : (1) interrogation angulaire, utilisée par BIAcore, (2) interrogation en réflectivité utilisée par l’imagerie SPRi et (3) interrogation spectrale.

l’interface est effectuée en mesurant le déplacement Δθr du minimum de réflectivité de la courbe de plasmon à l’aide d’une barrette de photodiodes. Par ailleurs, l’appareil SPRi-Plex II de chez HORIBA-Scientific, est basé sur l’interrogation en réflectivité. Le faisceau de lumière incident, possède une longueur d’onde et un angle incident fixe, et la lumière réfléchie est captée par une caméra CCD; cette dernière permet l’enregistrement de l’évolution de l’intensité de la lumière au cours du temps.

2.1.3.1. L’appareil BIAcore

Le schéma de principe de L’appareil BIA3000 est représenté en figure 26. Cet appareil est constitué d’un prisme qui vient en contact avec une puce d’or, décrite plus haut. Un système microfluidique, comprenant deux pompes, assure une circulation du fluide avec un débit contrôlé à la surface de la puce (Fig. 26-C). La pompe 1 assure la circulation du tampon de course en continu, alors que la pompe 2 ne s’active que lors des injections en redirigeant le tampon de course vers la seringue chargée avec l’échantillon à injecter. L’appareil BIA3000 comporte 4

Fig. 26 : Représentation schématique de l’appareil Biacore : (A) La puce d’or est en contact avec le prisme, et la cellule fluidique forme 4 canaux (pistes) fluidiques successifs, à la surface de la puce. Les résultats collectés sont présentés sous forme du changement de l’angle du plasmon (∆θ) en fonction du temps. (B) Les 4 pistes fluidiques. (C) Représentation du système fluidique de BIA3000. Hors injections, le tampon de course circule toujours à la surface de la puce par l’action de la pompe n.1, lors de l’injection d’un échantillon/réactif, c’est la pompe n.2 qui sera activée.

68 canaux fluidiques (Fig. 26-A et B), de 1mm2 chacun, qui peuvent fonctionner simultanément ou séparément. Le système de détection est formé d’un laser, avec une longueur d’onde de 760 nm, et de barrettes de photodiodes reliées à un ordinateur, et qui permettent de suivre les perturbations des plasmons de surface par interrogation angulaire en mesurant le déplacement ∆θ du minimum de réflectivité au cours du temps. Ainsi, il a été établi, de façon empirique, une corrélation entre la variation d’angle et celle de masse de molécules déposées sur la puce (∆θ=0,1°  1ng/mm2₎291_{. Le ∆θ est fourni sous forme d’une unité arbitraire, RU (pour Response} Unit), avec 1000 RU = ∆θ=0,1°.

L’appareil BIA3000, offrant la capacité de travail sur 4 pistes de manière séparée, a été préférentiellement utilisé pour les tests de détermination des meilleures conditions de greffage des ligands, appelés tests de préconcentration (cf partie «Optimisation des conditions de greffage des ligands»). Cet appareil favorise le criblage des conditions réactionnelles en permettant le suivi de différentes injections des ligands à différents pH sur chaque piste.

2.1.3.2. L’appareil SPRi-Plex II

L’appareil SPRi-Plex II consiste en une source laser monochromatique polarisé (Transverse Magnétique) ayant une longueur d’onde de 810 nm. L’utilisateur peut choisir l’angle de travail optimal après balayage de la surface avec le faisceau grâce au miroir motorisé. Le laser ensuite traverse un prisme de haut indice optique (np= 1,76), avec un angle incident donné, et interagit avec la couche d’or tout en étant réfléchi. Le faisceau réfléchi est ensuite capté par une caméra CCD, elle-même reliée à un ordinateur (Fig. 27). L’intensité de la lumière réfléchie va pouvoir être enregistrée en fonction de l’angle d’incidence du faisceau incident, il en résulte la courbe plasmon.

L’imagerie SPR permet de mesurer la variation de réflectivité moyenne sur des zones prédéfinies par l’utilisateur sur la surface de la puce. Ces zones que l’on nommera ROI (Region

Fig. 27 : Représentation schématique du système optique de l’appareil SPRi- Plex II.

Of Interest) sont de forme circulaire et de taille variable (30 à 8000 μm). Il peut être choisi jusqu’à 500 ROIs par puce, qui sont judicieusement choisis sur les zones présentant les biorécepteurs et sur les zones contrôle. Le choix de l’angle de travail θt à fixer est commun à chaque ROI, l’utilisateur doit donc choisir l’angle le plus judicieux en fonction de l’expérience à réaliser. Dans la pratique, θt sera fixé à la pente maximale de la courbe plasmon des ROIs présentant le plus grand intérêt en s’aidant des valeurs de la dérivée affichées par le logiciel.

Au niveau expérimental, une corrélation a été établie entre le changement en réflectivité (%) et la quantité de matière déposée à la surface : +1% de réflectivité correspond à 125 pg/mm2 de matériel déposé 292.

Une fois l’angle de travail fixé, les interactions peuvent avoir lieu grâce à un dispositif fluidique ajusté à la surface de la biopuce (Figure 28). Ce dispositif est équipé d’une pompe permettant la circulation du tampon de course à un débit contrôlé. Le SPRi, possède un dégazeur, en amont de la pompe, qui permet d’éliminer les bulles contenues dans le tampon de course. Ainsi, la pompe est connectée à une valve qui, selon sa position, permet d’acheminer le tampon de course soit directement dans la cellule fluidique soit dans la boucle d’injection pour pousser l’échantillon dans

Fig. 28 : (A) Représentation schématique du système fluidique de SPRi-Plex II. Les deux configurations de la valve sont représentées. La première (en haut) en position de chargement, dans laquelle le tampon de course circule en continu et directement dans la chambre fluidique. Pendant ce temps-là, en parallèle il est possible de charger la boucle d’injection avec l’échantillon à injecter en utilisant une seringue. La 2ème est la position d’injection (dans le cadre en bas) où le tampon de course est dirigé dans la boucle d’injection afin de pousser l’échantillon jusque dans la cellule fluidique. (B) Appareil SPRi-Plex II utilisé dans le cadre de ce travail et (C) la boucle d’injection du système.

70 la cellule fluidique, et donc sur la puce.

L’imagerie SPR (SPRi), et SPRi-Plex II précisément, est capable de mesurer le plasmon d’une zone de 1 cm2 _{lui permettant d’étudier de multiples interactions simultanément. De plus, la} caméra CCD offre une image en contraste de phase de la surface de la puce pendant l’expérience, ce qui offre une visualisation claire des différents spots de ligands et le suivi du phénomène d’interaction (capture, adsorption…) via l’augmentation du contraste.

Le tableau 6 montre une comparaison entre les deux instruments (BIA300 et SPRi-Plex II) utilisés dans le cadre de ce travail.