III. Mise au point des calibrants
2. Résultats
2.5. Corrélation entre le signal SPR et la densité surfacique en particules capturées
dans ce projet, BIA3000 et SPRi-Plex II, sont des techniques permettant le suivi de la capture des vésicules. Cependant le taux de capture est donné sous forme d’une quantité moyenne de matière/ unité de surface (ng/mm2). Nous avons voulu étudier la corrélation entre le signal SPR obtenu suite à la capture des calibrants par la surface et la densité de particules à la surface (nombre de particules/mm2) déterminée par microscopie. La densité surfacique (nombre de particules/mm2) a été évaluée par AFM pour les CP50 et microscopie optique pour les CP920.
2.5.1. Capture et comptage des CP50
Les CP50 ont été injectées, en BIA3000, à des concentrations différentes sur les 4 pistes d’une puce, donnant des taux de capture de 190, 890, 1800 et 3160 RU respectivement sur FC1, 2, 3 et 4. Différentes zones de chaque piste ont été scannées en AFM dans le but d’avoir une vue représentative de la densité des CP50 à la surface de chaque piste. La Fig. 59 présente des images AFM pour les différents canaux (FC1, 2, 3 et 4).
L’analyse AFM montre que la densité surfacique en particules est directement proportionnelle au signal SPR obtenu en BIA3000. La densité moyenne des CP50 sur le canal 1 est de 3,08±1,24 x106 CP50/mm2 ce qui correspond à 190 RU en taux de capture soit 190 pg/mm2, (Fig. 59-A). Les densités moyennes de CP50 sur les pistes 2 et 3 sont de 7,72±1,78 x106 et 19,45±4,02 x106 CP50/ mm2 pour des signaux SPR de 890 RU (890 pg/mm2) et 1800 RU (eq. 1800 pg/mm2), respectivement (Fig. 59 -B et C). Sur le canal 4, le signal de 3160 RU a été obtenu suite à l’injection de CP50 jusqu’à la saturation de la surface du canal; le scan AFM de ce canal montre une couche dense de CP50 ce qui confirme la saturation de la surface. La densité des particules sur ce canal a été estimée à 43,5±3,54 x106 CP50/mm2 (Fig. 59 -D).
La Fig. 59 - E montre la relation entre la densité de CP50 à la surface (cercle rouge), determinée par les images AFM, et le signal SPR (RU). La courbe montre une relation linéaire entre ces deux paramètres (R2=0,964). Sur la même courbe, nous présentons la concentration de
114 CP50 en solution (CP50/mL) injectée sur chaque piste pour obtenir le taux de capture donné (carré bleu). Ces résultats montrent que la densité surfacique en particules est reliée au taux de capture mesuré en SPR. Cela signifie que la contribution du signal SPRi obtenu suite à l’injection des calibrants est essentiellement liée à la capture des CP sur la surface. Le signal SPR est lui- même relié à la concentration des particules dans la solution injectée, ce qui permet d’atteindre la quantification des particules en solution (Des images pour les 4 pistes sont présentées dans l’annexe 6).
D’autre part, nous avons comparé ces résultats expérimentaux avec les données théoriques dont nous disposions sur les CP50. En effet, une CP50 présente une masse de ≈1x10-10 µg (voir annexe 4). Le taux de capture de 190 RU sur le FC1 reflète une quantité de matériel brute capturée de 190 pg/mm2 qui correspond à une densité théorique de 1,9x106 CP50/mm2.Cette valeur est proche de celle trouvée expérimentalement, par AFM, et qui est de à 3,08x106 CP50/ mm2. De même, les densités surfaciques théoriques sur FC2 (890 RU), FC3 (1800 RU) et FC4 (3160 RU) sont égales à 8,9x106 , 18x106 et 31,6x106 CP50/mm2 respectivement. Ces valeurs sont également proches de celles obtenues expérimentalement par AFM et qui étaient de 7,72x106, 19,45±4,02 x106 et 43,5x106 CP50/mm2 pour FC2, FC3 et FC4 respectivement.
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A
B
C
D
E
Fig. 59 : Corrélation capture / concentration / densité surfacique pour les CP50 : A, B, C et D montrent des images AFM des pistes présentant 190, 890, 1800 et 3160 RU sur FC1, FC2, FC3 et FC4 respectivement obtenus après capture des CP50 via l’ α-CP50. Echelle en z de 10 nm. (E) corrélation entre le signal SPR (RU) et la densité surfacique des CP50 (nombre de CP50/mm2) (cercles rouges) ; Les carrés bleus correspondent à la concentration de CP50 injectée pour obtenir le signal SPR correspondant.biomimétiques que sont les CP50.
2.5.2. Capture et comptage des CP920
De la même façon, afin d’étudier la relation entre le taux de capture obtenu comme signal SPRi (%) et la densité de CP920 à la surface de la biopuce, ces derniers ont été injectés à différentes concentrations sur une puce présentant des spots de leurs anticorps spécifiques α- CP920.
La densité surfacique en CP920 est proportionnelle au taux de capture avec des valeurs de 1,74x103 ; 2,62x103 ; 6,09x103 et 1,02x104 CP920/mm² pour des taux de capture de 1 ; 1,3 ; 2 et 3,7 % respectivement (Fig. 60).
La corrélation entre les résultats expérimentaux et les données théoriques est plus difficile à montrer ici de par la taille micrométrique des CP920. En effet, le plasmon se propage à un
Fig. 60 : Corrélation capture/concentration/densité surfacique pour les CP920 (A). Les carrés bleus correspondent à la concentration de CP920 en solution injectée pour obtenir le signal le signal SPRi correspondant. Chaque injection a été performée pendant 2 minutes. (B), (C), (D), et (E) montrent des images obtenues par microscopie optique des spots α-CP920 à des taux de capture de 1; 1,5 ; 2 et 3,7%. La barre d’échelle correspond à 50 μm.
A
116 maximum de 200 nm de la surface de la puce et les billes sont environ 5 fois plus grandes que cette profondeur de propagation. Le signal SPRi généré suite à la capture des CP920 ne correspond donc qu’à une partie du matériel capturé. Aussi, la conversion du signal SPRi en quantité de matière (1% = 125 pg/mm²) a été déterminée en utilisant un modèle protéique. Cette conversion n’est donc pas strictement applicable à des vésicules synthétiques telles que les CP920.