Les différents outils analytiques des composés volatils

6.1Chromatographie phase gazeuse

La chromatographie en phase gazeuse est une technique connue. Comme toutes les techniques de chromatographie, elle permet de séparer des molécules d'un mélange éventuellement très complexe de nature très diverses. Elle s'applique principalement aux composés gazeux ou susceptibles d'être vaporisés par chauffage sans décomposition. Le système d’injection de la GC du laboratoire est un système split / splitless. Ensuite le mélange à analyser est vaporisé à l'entrée d'une colonne, qui renferme une substance active solide ou liquide appelée phase stationnaire (colonne SLB-5ms : 5%-phényl-95%-polydiméthylsiloxane (60m × 0.25mm × 0.25µm)), puis il est transporté à travers celle-ci à l'aide d'un gaz porteur (hélium). Les différentes molécules du mélange vont se séparer et sortir de la colonne les unes après les autres après un certain laps de temps qui est fonction de l'affinité de la phase stationnaire avec ces molécules. Dans notre étude les composés seront analysés par spectrométrie de masse et olfactométrie.

6.2Spectrométrie de masse

6.2.1 Structure d'un spectromètre de masse

Le spectromètre de masse, initialement conçu par le britannique Joseph John Thomson, comporte une source d'ionisation suivie d'un ou plusieurs analyseurs qui séparent les ions produits selon leur rapport m/z, d'un détecteur qui compte les ions et amplifie le signal, et

enfin d'un système informatique pour traiter le signal. Le résultat obtenu est unspectrede

masse représentant les rapportsm/z, où m représente la masse et z la valence des ions

détectés selon l'axe des abscisses et l'abondance relative de ces ions selon l'axe de ordonnées.

Le spectromètre de masse se compose donc de quatre parties :

Le système d’introduction de l’échantillon : l’échantillon peut être introduit directement

dans la source, sous forme gazeuse, liquide (infusion directe) ou solide (canne d’introduction directe, dépôt sur plaque MALDI, ...) ou encore par l'association à une

méthode séparative (chromatographie en phase liquide,chromatographie en phase

gazeuse,électrophorèse capillaire, ...).

La source d'ionisation :elle consiste à vaporiser les molécules et à les ioniser. Une source

d'ionisation peut être utilisée soit en mode positif pour étudier les ions positifs, soit en mode négatif pour étudier les ions négatifs. Plusieurs types de sources existent et sont utilisés en fonction du résultat recherché et des molécules analysées.

- L'ionisation électronique (EI), l'ionisation chimique (CI) et la désorption-ionisation

chimique (DCI)

- Le bombardement par atomes rapides (FAB), atomes métastables (MAB) ou ions

(SIMS, LSIMS)

- Le couplage plasma inductif (ICP)

- L'ionisation chimique à pression atmosphérique(APCI) et la photoionisation à

pression atmosphérique (APPI)

- L'électronébulisationou électrospray (ESI)

- Ladésorption-ionisation laser assistée par matrice(MALDI), activée par une

surface (SELDI) ou sur silicium (DIOS)

- L'ionisation-désorption par interaction avec espèces métastables (DART)

L’analyseur :il sépare les ions en fonction de leur rapport masse/charge (m/z). Il existe

des analyseurs basse résolution : le quadripôle ou quadrupôle (Q), le piège à ions 3D (IT) ou linéaire (LIT), et des analyseurs haute résolution, permettant de mesurer la masse exacte des analytes : le secteur magnétique couplé à un secteur électrique, le temps de vol (TOF), la résonance cyclotronique ionique à transformée de Fourier (FTICR) et l'Orbitrap. Ces analyseurs peuvent être couplés entre eux pour réaliser des expériences de spectrométrie de masse en tandem (MS/MS). En général, un premier analyseur sépare les ions, une cellule de collision permet de fragmenter les ions, et un second

analyseur sépare les ions fragments. Certains analyseurs, comme les pièges à ions ou le FT-ICR, constituent plusieurs analyseurs en un et permettent de fragmenter les ions et d'analyser les fragments directement.

Le détecteur et système de traitement :le détecteur transforme les ions en signal

électrique. Plus les ions sont nombreux, plus le courant est important. De plus, le le signal détecté est amplifié pour qu'il puisse être traité informatiquement.

Pour l’analyse des composés volatils dans notre étude, une ionisation électronique est utilisée et l’analyseur est un quadripôle. La spectrométrie de masse est un système Shimadzu QP2010+.

6.2.2 L'ionisation électronique (EI)

Des électrons émis par un filament rencontrent les molécules qui entrent dans la source : lors de la rencontre, si l'énergie cinétique des électrons est suffisante, un électron est

arraché de la molécule M, la transformant en un ion radical M^+o (Figure 6). Celui-ci peut

ensuite se fragmenter suivant son énergie interne. L'EI conduit ainsi à un spectre assez fourni, avec de nombreux fragments, très riche en informations structurales.

Figure 6 : Source d'ionisation électronique

L’ionisation électrique est la méthode la plus utilisée parmis les sources d’ionisation et celle qui donne le plus de fragments.

Mécanisme de l’ionisation électronique

L’impact d’un électron très énergétique sur une molécule transforme cette dernière en radical-cation avec la perte d’un électron. Suivent une série de réarrangements ou fragmentations qui dépendent de la nature et de la structure de la molécule.

6.2.3 L’analyseur quadripôle.

Un quadripôle (ou quadrupôle) est constitué de quatre électrodes parallèles de section

hyperbolique ou cylindrique (Figure 7). Les électrodes opposées distantes de 2r0 sont reliées

entre elles et soumises au même potentiel. Les électrodes adjacentes sont portées à des

potentiels de même valeur, mais opposés de sorte que l'écart de potentiel soit égal à φ0.

Ce potentiel φ0 résulte de la combinaison de tensions, l'une continue (U) l'autre alternative

(V) de haute fréquence f :

En appliquant cette différence de potentiel entre chaque paire d'électrodes, il se crée un champ électrique quadripolaire. Un point de coordonnées (x, y, z) situé dans le champ électrique sera alors soumis au potentiel :

La trajectoire d'un ion pénétrant dans le quadripôle sera donc uniforme selon l'axe z et décrite par les équations de Mathieu selon les deux autres axes. Il est possible de définir en fonction des valeurs U et V des zones de stabilité telles que les coordonnées x et y de l'ion

restent strictement inférieures à r0. L'une d'entre elles est exploitée en spectrométrie de masse (Les ions qui se trouvent dans cette zone auront donc une trajectoire stable (ion en résonance) dans le quadripole et seront détectés). En gardant constant le rapport U/V, on obtient une droite de fonctionnement de l'analyseur. Un balayage de U avec U/V constant permet l'observation successive de tous les ions dont la zone de stabilité est coupée par la droite de fonctionnement. La résolution entre ces ions est d'autant plus grande que la pente de la droite est élevée. En l'absence de tension continue, tous les ions de rapports m/z

supérieurs à celui fixé par la valeur de V appliquée auront une trajectoire stable (x et y < r0),

le quadripôle est alors dit transparent et sert de focalisateur d'ions. Les principaux avantages du spectromètre quadripolaire résident dans sa souplesse d'utilisation, sa résolution unitaire sur toute sa gamme de masse, sa vitesse de balayage satisfaisante, ainsi que son adaptabilité à différentes interfaces permettant le couplage avec la chromatographie gazeuse ou liquide.

Figure 7 : Schéma d’un filtre quadrupolaire

6.3L’olfactométrie

Le terme 'olfactométrie' désigne à la fois la mesure des odeurs et la mesure des capacités

olfactives. Cette technique est utilisée dans notre sujet pour identifier les odeurs des poissons et identifier les composés volatils qui sont responsable de ces odeurs.