Les champignons filamenteux

L‘identification a été réalisée sous microscope : nous avons réalisé la technique du drapeau de Roth: un petit morceau de scotch est appliqué par sa face collante sur la colonie fongique àl‘aide d‘une pince, puis déposer sur une goutte de bleu de lactophénol sur une lameporte-objet. Une deuxième goutte est déposée sur la face supérieure du scotch puis ensuiterecouvert d‘une lamelle couvre-objet (Figure 69) [58]

Figure 69 : La technique du drapeau de Roth [photo de laboratoire de parasitologie-Mycologie HMIMV-Rabat]

Critères d’identification microscopique :

L‘examen microscopique d‘une colonie fongique se fait après réalisation d‘un étalement entre lame et lamelle et coloration de la préparation au bleu coton. Généralement, un examen à l‘objectif 40 est suffisant pour mettre en évidence la plupart des éléments importants de diagnose[169]

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- Le thalle : tous les champignons possèdent un appareil végétatif constitué de filaments (hyphes) qui, ensemble, forment le thalle filamenteux ou le mycélium ; le thalle peut êtresiphonné ou septé :

- Le thalle siphonné, constitué d‘éléments tubulaires, peu ou pas ramifié, de diamètre large etirrégulier (5-15 µm), non cloisonné est caractéristique des Zygomycètes ; - Le thalle septé ou cloisonné, constitué de filaments de diamètre étroit (2-5 µm) et

régulier, divisé par des cloisons en articles uni ou pluricellulaires est caractéristique des Ascomycètes, Basidiomycètes et Deutéromycètes[55]

- Les spores : qui sont le produit de la reproduction asexuée peuvent être endogènes ou exogènes

- Les spores endogènes (endospores) sont produites à l‘intérieur d‘un sac fermé (sporange), porté par un filament spécialisé (sporangiophore). Ces spores, que l‘on observe par exemplechez les Mucorales, sont libérées par le déchirement de la paroi de sporange à maturité.

- Les spores exogènes (conidies), retrouvées chez les Ascomycètes, Basidiomycètes etDeutéromycètes, sont formées par bourgeonnement à partir d‘une cellule spécialisé (celluleconidiogène).

L‘examen des spores et de leur organisation est une étape importante de l‘identification fongique [170]

- les organes de fructifications : présence ou non d‘organes protecteurs des conidies, modes de formation des conidies (issues directement du thalle, solitaires (aleuriospores) ou en chaines (arthrospores), ou produites par bourgeonnement et regroupées soit en grappes, en masse, en têtes ou en chaînes basipètes ou acropètes), modes d‘implantation des cellulesconidiogènes [indifférenciée ou peu indifférenciée, différenciées (sur le filament végétatif, porté sur les conidiophores dispersés ou groupés)] [171]

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Figure 70 : Organes de fructifications du genre Aspergillus (A) et du genre Rhizopus (B). [171]

-Organe spéciaux : vrilles, rhizoïdes (Figure 71-72)

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Figure 72 : Aspect microscopique de Rhizopus stolonifer avec présence de rhizoïdes

-Vitesse de pousse des colonies

La vitesse de la pousse des colonies ou la température de développement peuvent être de bons indicateurs pour l‘identification d‘une moisissure [171], on donne comme exemples deux espèces appartenant au genre Fusarium sp en précisant leur vitesse de croissance sur deux milieux (PDA, TANAKA)

 Fusarium solani var. coeruleum: Sa vitesse de croissance sur varie entre 3 et 3,8 mm par jour ;

 Fusarium oxysporum : La croissance de F. oxysporum sur ces milieux de culture, à 25 °C est comprise entre 7 et 7,4 mm par jour [172]

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3.3.2.2. Les levures

Identification microscopique

L‘identification microscopique a été reposée sur :

-un examen direct : une colonie est prélevée et déposer sur une lame porteobjet dans une goutte de colorant (bleu coton ou rouge Congo). Cet examenpermet de noter la forme, la taille, et le mode de reproduction asexuée (bourgeonnement ou scissiparité) des levures. -tests spécifiques : spécialement pour l‘identification de Candida albicans. Cette levure est la plus fréquente en pathologie humaine est la levure la plus rapide à identifier par différents tests :

*Le test de Blastèse : appelé aussi le teste de filamentation en sérum, il estréalisé on déposant une colonie de levure dans 1 ml de sérum lapin frais. Cette suspension préparée doit être incubée à une température de 37C° pendant 3 heures. La détection des filaments (tubes germinatifs) affirme la présence de Candida albicans [173]

Figure 73 : Tubes germinatifs caractéristique de candida albicans observée au microscope

*Le test dechlamydospores:Son but c‘est la différenciation de Candidaalbicans d'autres

Candidspsur la base de la formation des chlamydospores. Pour cela, une goutte de suspension

de levure est ensemencée sur milieu de Rice-Cream (gélose à l‘extrait de riz) puis incubation entre 23 et 28 °C à la température ambiante pendant 18 à 48 h [174]

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Figure 74 : Chlamydospore de candida albicans après test de chlamydosporulation [175]

Identification biochimique

L‘étude de la forme des levures ne suffit pas pour la détermination des espèces ce qui nous a pousser d‘étudier leurs caractères physiologiques avec en particulier, l‘étude de l‘assimilation des sucres, en utilisant des galeries API et un automate VITEK.

API® 20C AUX (bioMérieux)

a-Principe générale

La galerie API 20 C AUX est constituée de 20 cupules contenant des substrats déshydratés qui permettent d'effectuer 19 tests d'assimilation. Les cupules sont inoculées avec un milieu minimum semi-gélosé et les levures poussent seulement si elles sont capables d'utiliser le substrat correspondant. La lecture de ces réactions se fait par comparaison aux témoins de croissance et l'identification est obtenue à l'aide du Catalogue Analytique (Figure 75) ou d'un logiciel d'identification.

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Figure 75 : Exemple d’identification à l’aide du Catalogue Analytique

b-Composition de la galerie

106 c.Mode opératoire

c.1.Préparation de la galerie

-Réunir fond et couvercle d'une boîte d'incubation et répartir environ 5 ml d'eau distillée dans les alvéoles du fond pour créer une atmosphère humide.

-Inscrire la référence de la souche sur la languette latérale de la boîte.

-Retirer la galerie de son emballage individuel et la déposer dans la boîte d'incubation. c.2.Préparation de l'inoculum

-Ouvrir une ampoule d‘API Suspension Medium (2 ml) ou une ampoule d‘API NaCl 0,85 % Medium (2 ml), ou utiliser un tube contenant 2 ml de la même solution sans additif.

-A l'aide d'une pipette, prélever une fraction de colonie par aspiration ou par touches successives. Utiliser préférentiellement des cultures jeunes (18-24 heures).

-Réaliser une suspension de levures de turbidité égale à 2 de McFarland. Cette suspension doit être utilisée extemporanément.

-Ouvrir une ampoule d‘API C Medium et y transférer environ 100 µl de la suspension précédente. Homogénéiser avec la pipette en évitant la formation de bulles

c.3.Inoculation de la galerie

-Remplir les cupules avec la suspension obtenue dans API C Medium. Eviter la formation de bulles en posant la pointe de la pipette sur le côté de la cupule. Veiller à créer un niveau horizontal ou légèrement convexe, mais jamais concave

-Refermer la boîte d'incubation et incuber 48-72 heures (± 6 heures) à 29°C ± 2°C.

d.Lecture et interprétation d.1.Lecture de la galerie

Après 48 heures d'incubation, ou 72 heures, observer la croissance des levures comparativement à la cupule 0, témoin négatif. Une cupule plus trouble que le témoin indique une réaction positive à noter sur la fiche de résultats (figure 76).

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Figure 76 : Galerie API avec certaines cupules troubles (Tête de flèche)

d.2.Interprétation

L'identification est obtenue à partir du profil numérique. *Détermination du profil numérique :

Sur la fiche de résultats, les tests sont séparés par groupes de trois et une valeur 1, 2 ou 4 est indiquée pour chacun. En additionnant à l'intérieur de chaque groupe les valeurs correspondant à des réactions positives, on obtient 7 chiffres qui constituent le profil numérique.

*Identification :

Se fait à l'aide du Catalogue Analytique : Rechercher le profil numérique dans la liste des profils.

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2-Vitek® YBC (bioMérieux)

VITEK 2™ est un système automatisé composé d'instruments, d‘un logiciel et de cartes destinées à l'identification et l‘antibiogramme de bactéries et de levures. Le VITEK 2™ utilise la croissance basée sur des profils biochimiques pour déterminer l'identification.

- Le dispositif Vitek® YBC (bioMérieux) comporte 20 tests, la sensibilité à l‘Actidione, l‘assimilation du nitrate, l‘hydrolyse de l‘urée et l‘assimilation de 17 sources de carbone. Ce système entièrement automatisé permet l'identification de 50 taxons.

Figure 78 : Vitek® YBC (bioMérieux)

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Figure 79 : Carte d’identification Vitek 2(A), préparation de la suspension de levures(B), mesure de la turbidité de la suspension (C)

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II. Résultats

Sur 54 échantillons de sables prélevés pour chaque plage et 270 prélèvements étudiés, 26 souches de champignons ont été isolées des Cinq plages étudiées, avec une fréquence d‘isolement de 9,62 %.

Pour les champignons filamenteux non dermatophytiques, il s‘agit de 14 souches d‘Aspergillacea, dont :

- 7 Aspergillus niger; - 5 Apergillus flavus ; - 2 Aspergillus terreus. 4 souches de Fusarium sp, dont :

- 3 Fusarium oxysporum ; - 1 Fusarium solani.

2 souches de penicillium chrysogenum, ainsi que deux souches de Scedosporium

apiospermum et 1 souche de Rhizomucor sp.

Pour les levures, 3 souches de Candida parapsilosis ont été isolées. Concernant les dermatophytes, aucune souche n‘a été isolée.

Le traitement de données obtenues dans cette étude a été effectué par le logiciel Excel 2007 au lieu de SPSS qui est logiciel est un logiciel puissant, qui n‘accepte pas des données minimes avec une fréquence d‘isolement faible.

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1. Répartition des espèces isolées