Le transfert d’énergie bioluminescente par résonance (BRET)

La bioluminescence est un phénomène observé chez beaucoup d’êtres vivants qui consiste en la production de lumière grâce à la dégradation d’un substrat par une enzyme, la luciférase [193]. Il existe différents types de luciférases utilisant différents types de substrats selon les organismes dont elles proviennent [194]. Ces luciférases sont à la base du BRET.

La principale différence entre le FRET et le BRET est que le BRET utilise une enzyme de type luciférase comme donneur d’énergie. L’accepteur est toujours un fluorophore. Cette différence constitue le premier avantage du BRET par rapport au FRET car l’excitation du donneur ne nécessite plus un laser externe. Elle est donc spécifique et ne risque pas d’exciter l’accepteur ou les protéines intracellulaires. De plus, la luciférase n’est pas sujette au phénomène de photoblanchiment ce qui permet l’enregistrement de signaux BRET pendant une durée relativement importante (plusieurs minutes).

La luciférase utilisée en BRET est issue de l’anémone de mer Renilla reniformis et appelée Renilla Luc ou Rluc. C’est une protéine de 36 kDa dont la structure a pu être cristallisée en 2007 [195] (Figure 24). Elle produit de la lumière et de l’énergie par oxydation de son substrat, une coelenterazine, molécule perméable aux cellules et non-toxique. L’énergie peut être transmise par résonance à une autre protéine de type GFP existant chez Renilla reniformis, la Renilla GFP, qui entre alors dans un état excité. Ce transfert d’énergie bioluminescente par résonance est régi par les principes du RET quant au recouvrement spectral, à l’orientation des dipôles et à la distance entre les partenaires.

Nom Ex (nm) Em (nm) Brillance relative (% de EGFP) Structure quaternaire mOrange 548 562 146 Monomère dTomato 554 581 142 Dimer DsRed 558 583 176 Tétramère DsRed2 563 582 72 Tétramère DsRed-Express 555 584 58 Tétramère DsRed-monomer 556 586 10 Monomère mRuby 558 605 117 Monomère mApple 568 592 109 Monomère mStrawberry 574 596 78 Monomère mRFP1 584 607 37 Monomère mCherry 587 610 47 Monomère mRaspberry 598 625 38 Monomère

Figure 24 : Structure de la luciférase de Renilla reniformis.

Structure de la luciférase de Renilla reniformis en présence de coelenterazine (figure d’après PBD 2PSJ).

Le premier couple donneur/accepteur développé a donné naissance au BRET de première génération, le BRET1_{. L’enzyme Rluc et son substrat, la coelenterazine h, sont utilisés}

comme donneur d’énergie et la EYFP comme accepteur d’énergie (Figure 25 A). Les spectres d’émission de ces deux partenaires, 480 nm et 530 nm respectivement, sont assez proches ce qui génère, comme dans le cas du FRET, une contamination importante par les photons émis par le donneur dans le filtre captant les photons émis par l’accepteur. Pour pallier ce problème, l’entreprise Packard a développé un nouveau substrat et un nouvel accepteur créant ainsi une deuxième génération de BRET, le BRET2_{. La nouvelle coelenterazine, la coelenterazine 400a}

aussi appelée DeepBlueC (DBC), permet de décaler le pic d’émission de la Rluc à 400 nm. Les protéines fluorescentes GFP10 ou GFP2, dérivées de la GFP, possèdent un pic d’absorption à 400 nm et un pic d’émission à 510 nm et ont été spécialement développées pour être utilisées comme accepteuses d’énergie, Le recouvrement spectral du couple Rluc-DBC/GFP2 permet un bon transfert d’énergie tout en permettant une très bonne séparation des pics d’émission (Figure 25 B). Grâce à ce nouveau couple, le BRET2 _{est ainsi beaucoup plus sensible puisque le}

bruit de fond est quasiment inexistant, permettant la détection de très faibles signaux RET. L’utilisation de la coelenterazine 400a permet au BRET2 _{d’avoir une meilleure}

résolution spectrale par rapport au BRET1 _{mais diminue fortement l’intensité de luminescence}

émise par la Rluc, nécessitant souvent la surexpression importante des partenaires fusionnés à la Rluc et reléguant l’utilisation du BRET2 _{au second plan. Pour pallier à ce problème, dans les}

années 2000, le Dr. Gambhir et son équipe ont généré par mutations aléatoires des protéines dérivées de la RLuc afin d’en améliorer les propriétés spectrales. Ils ont ainsi obtenu différentes protéines dont deux se distinguent : la Rluc-M obtenue après 2 mutations dans la Rluc native, et la Rluc8, obtenue après 8 mutations au sein de la Rluc native, présentent une intensité de luminescence respectivement 20 et 30 fois supérieure en présence de coelenterazine 400a à celle de la Rluc native sans modification des longueurs d’ondes d’absorption et d’émission [195, 196]. La Rluc8 est également très stable et permet ainsi l’enregistrement de signaux BRET pendant un temps plus long. Du fait de ces optimisations, le nouveau BRET2 _{représente un outil de choix pour mesurer des interactions inter-protéiques}

mais également des réarrangements structuraux intra-protéiques, c’est pourquoi nous l’avons utilisé dans ce travail de thèse.

Figure 25 : Propriétés spectrales du BRET1 _{et du BRET}2_.

Les différences majeures entre les deux configurations BRET, BRET1 _{(A) et BRET}2 _{(B), sont les substrats utilisés}

(coelenterazine h pour le BRET1_{, coelenterazine 400a pour le BRET}2_{) ainsi que le type de protéine fluorescente}

utilisée comme accepteur d’énergie (YFP dans le cas du BRET1 _{et GFP2 dans le cas du BRET}2_{). La différence entre}

la Rluc et la Rluc8 vient de mutations permettant d’augmenter l’intensité de luminescence de la Rluc8 comparée à la Rluc (D’après [197]).

Initialement, le BRET1 _{et le premier BRET}2 _{n’étaient pas suffisamment sensibles pour}

permettre l’imagerie des signaux BRET dans les cellules en microscopie du fait de la faible intensité des photons émis par la luciférase. L’optimisation des couples donneur/accepteur d’énergie, en termes d’intensité et de contraste, associée au développement de nouveaux appareils de détection beaucoup plus sensibles utilisant notamment un dispositif à transfert de charge refroidi (CCCD/cooled charge-coupled device) a permis d’étendre l’utilisation du BRET2

à la visualisation des interactions protéiques en cellules vivantes mais également in situ chez le petit animal [196, 198-200].

Comparé au FRET et au BRET1_{, le BRET}2 _{utilisant la Rluc8, et la coelenterazine 400a, en}

donneur d’énergie et la GFP2 en accepteur d’énergie présente donc de nets avantages, en termes de résolution spectrale, de sensibilité et de spécificité et peut en plus être utilisé in vivo, c’est pourquoi nous avons choisi d’utiliser cette technologie pour le développement de notre outil de mesure de l’activité des PI3K.